| 研究課題/領域番号 |
17K17081
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
逸見 晶子 東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (40613055)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 石灰化 / SEM-EDX / 骨 / 軟骨 / 象牙質 / 免疫染色 / 質量顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度まで、軟骨内骨化における軟骨の石灰化を対象として、ミネラロームを検討するために、生後２週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定し、非脱灰でパラフィン包埋し試料として利用した。切片をミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度についてSEM-EDXを利用して解析した。また、基質のタンパクの分布については、抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色で検討し、SEM-EDXおよび蛍光抗体法の実験条件を確立した。平成30年度では、生後２週齢ラットを新たに固定し、下肢の非脱灰パラフィン包埋試料を作製し、検討を進めた。研究代表者の妊娠以降、体調管理のため研究活動を制限せざるを得ず、１０月以降、研究を中断した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究代表者が、出産と育児のため、１０月以降、研究を中断したから。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１） 研究中断前に作製した4%パラホルムアルデヒド固定した生後２週齢ラット下肢の非脱灰パラフィン包埋試料を用いて、ミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度について、SEM-EDXを利用して可視化する。（２） SEM-EDX解析した切片に抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色を施し、II型コラーゲンおよびX型コラーゲンの分布を可視化する。（３） 画像統合ソフトを用い、SEM-EDX解析イメージングと免疫染色イメージングを組織切片上に設定した基準点を利用して統合し、ミネラルとII型コラーゲンおよびX型コラーゲンの位置情報を統合したイメージングとして可視化する。（４） 生後２週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定後、凍結包埋して連続切片を作製し、切片を質量顕微鏡解析用として導電性を持たせ酸化インジウムスズがコーティングしてある専用スライドガラスに載せる。切片は超低温フリーザーに保管する。（５） 超低温フリーザーに保管した切片を凍結乾燥し、組織切片上に基準点を機械的に設定し、蒸着操作なしに低真空モードに設定した走査電子顕微鏡でSEM-EDX解析し、下肢骨のミネラロームのSEM-EDX解析イメージングをデータとして取得する（７） 上記で保管した切片にDHB（2,5-ジヒドロキシ安息香酸）のマトリックスを塗布して、質量顕微鏡で検討し、試料のプロテオームを解析しデータを取得する。（８） 画像統合ソフトを用い、ミネラローム（SEM-EDX解析イメージング）と（７）プロテオーム（質量顕微鏡解析イメージング）を統合し、石灰化解析イメージングとして可視化する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請者が、出産と育児のため、10月以降研究を中断したことから研究の進捗が予定より遅れ、次年度使用額が生じた。
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