| 研究課題/領域番号 |
17K17085
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| 研究機関 | 沖縄科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
柴田 敏史 沖縄科学技術大学院大学, 生体分子電子顕微鏡解析ユニット, 研究員 (30725057)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 透過型電子顕微鏡 / 浸透圧ショック法 / 超解像顕微鏡 / GldJ局在 |
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| 研究実績の概要 |
バクテロイデーテス門に属する細菌は他の細菌とは異なる独自のタンパク質分泌機構であるIX型分泌機構(T9SS)を持ち、生育に必要な酵素類、病原性タンパ ク質を分泌するだけでなく、バクテロイデーテス細菌の滑走運動コンポーネントの一部としても機能する。本研究はT9SS分泌複合体を可視化・構造解析し、その分泌メカニズムの解明を目的とする。本年度は引き続きT9SS分泌装置の可視化と、複合体の単離離精製のさらなる条件検討を行なった。
T9SS分泌装置の可視化について、Porphyromonas gingivarisを用いた解析では以前から観察された外膜上のPorK・PorNリングが透過型電子顕微鏡にて観察でき再現性は得られたが、それらに付随するペリプラズム領域内の構造の詳細は得られなかった。並行して行なったFlavobacterium johnsoniae を用いた解析ではこれまでの浸透圧ショック法だけでなく、超解像顕微鏡を用いたT9SS関連滑走タンパク質GldJの局在解析を行なった結果、菌体外膜内側でのGldJはらせん状の局在が明らかになった。この局在様式は滑走運動中の菌体の動きを反映していると考えられる。また、収束イオンビーム加工観察装置を用いた菌体内部の観察も試みた。
T9SS分泌超分子複合体の単離精製に関して、P. gingivaris を用いると菌が生産するジンジパインプロテアー ゼの強力な分解活性のため困難であったため、F. johnsoniaeを用いて行なった。菌体の可溶化に用いる界面活性剤のスクリーニングを行い両性界面活性剤LDAOが適していることを決定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
T9SS分泌複合体の一部の可視化、構成タンパク質を含んだ祖抽出フラクションを得る事はできているが未だ全体像が明らかになっていないため。また、予定していたクライオ電子線トモグラフィー法による菌体内構造解析を試みることができなかったため。しかしながら構造体の単離精製過程で重要な菌体可溶化の至適条件を決定できたことから今後の進捗が期待できる。T9SS関連滑走タンパク質GldJの局在様式と滑走運動関連性に関する新規性のある結果を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
T9SS分泌装置の可視化について、ネガティブ染色に用いる重金属染色液による構造の不安定化を排除し生体条件下での構造解析が可能なクライオ電子線トモグラフィー法を用いた菌体観察を行う。
T9SS分泌超分子複合体の単離精製については、密度勾配遠心法などを用いて複合体のさらなる分離、濃縮を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
電子顕微鏡解析を所属機関で行うことが出来る様になり解析のための出張が不要になった。また所属研究室に十分量の電子顕微鏡グ リッド、試薬類があり購入を見送ったため繰越金が発生した。
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