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2017 年度 実施状況報告書

1回感染性ジカウイルス様粒子SRIPsを用いたジカ熱の病態解明とその制御法の確立

研究課題

研究課題/領域番号 17K17104
研究機関大分大学

研究代表者

神山 長慶  大分大学, 医学部, 助教 (50756830)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワードジカウイルス / SRIPs / アフリカ株 / アジア株
研究実績の概要

本研究では、ジカウイルスのアフリカ株がアジア株へ変異し強毒化したことによって、胎盤や血液脳関門の透過性が増したのではないかとの仮説を検証するために、ジカウイルスのアフリカ株およびアジア株の1回感染性ウイルス様粒子(SRIPs)を作製する。SRIPsは2次感染しないため、安全であり、遺伝子組み換え体の作製にあたっては大臣申請が不要であるため、容易に遺伝子組換えウイルス様粒子を用いた実験が可能である。
本研究で用いるSRIPsを作製するために、①pCMV-JErep, ②pCAG-JEC, ③pCAG-ZIKprMEの3種類のプラスミドベクターの構築が必要である。①はサイトメガロウイルスプロモーター下に日本脳炎ウイルスのNS1-5領域が組み込まれている。②はCAGプロモーター下に日本脳炎ウイルスのキャプシド領域が組み込まれている。③は CAGプロモーター下にジカウイルスのアフリカ株およびアジア株の前駆膜およびエンベロープ領域がそれぞれ組み込まれているものである。これら3種類のベクターを同時にHEK293T細胞にトランスフェクションすると、培養上清中にジカウイルスのアフリカ株およびアジア株のSRIPsがそれぞれ産生される。現在、①②のベクターは構築済みだが、③のベクターの作製途中である。すでにアフリカ株およびアジア株の前駆膜およびエンベロープ領域のクローニングは終えているため、 pCAGプラスミドベクターへクローニング生成物をインサートする段階である。①のレプリコンベクターにはルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれているため、SRIPsが感染した細胞はルシフェラーゼを発現する。これを利用することで、細胞実験においてはSRIPsの感染効率の確認やその定量化が可能となる。また、ジカウイルス感染モデルマウスを用いた実験では、組織中の感染細胞を定量化することが可能となる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

現在、③pCAG-ZIKprMEの3種類のプラスミドの作製中であり、これが完成すれば、ジカウイルスのSRIPsを得ることができる予定である。すでにジカウイルスのアフリカ株およびアジア株の前駆膜およびエンベロープ領域の増幅には成功している。さらに、この塩基配列がNCBIのデータベース上のものと一致していることをシーケンス解析にて確認しているため、まもなくpCAG-ZIKprMEが完成すると思われる。
同時に、日本脳炎ウイルスのSRIPsを作製するためのプラスミドベクターを準備した。これは細胞への有効な1回感染性が既に報告されているものである。これを陽性コントロールとして用いることで、ジカウイルスSRIPsの感染性を評価する予定である。
以上の理由より、実験はおおむね順調に進展していると言える。

今後の研究の推進方策

研究実績の概要に記載した③pCAG-ZIKprMEのプラスミドベクターの構築が完了したら、ジカウイルスSRIPsを作製し、ウイルス易感染性細胞株であるVero細胞に感染させ、ルシフェラーゼの発現を解析し、作製したSRIPsが感染力を有することを確認する。
次に、アジア株およびアフリカ株のウイルスやSRIPsをマウスに静脈内投与で感染させ、両株間で胎盤や血液脳関門の透過性、さらに胎児や脳への移行性に違いがあるかRT-PCR法やルシフェラーゼアッセイを用いて解析する。近年、ジカウイルスの前駆膜領域の1アミノ酸置換がヒトに対する病原性の上昇に関わることが報告された。しかし、このアミノ酸置換以外にも、病原性の違いに関わる変異が存在する可能性がある。両株のSRIPs間で病原性の違いが確認された場合、その候補となる変異をデータベースから検索し、アジア型をアフリカ型に変化させたSRIPs、またはアフリカ型をアジア型に変化させたSRIPsを作製し、その胎盤や血液脳関門の透過性、胎児や脳への移行性を観察する。これにより、ジカウイルスの病原性を規定する強毒化因子を同定する。

次年度使用額が生じた理由

SRIPsを発現させるためのプラスミドのクローニングに必要なPCR反応や大腸菌への形質導入の効率が良かったため、当初の計画よりも少ない回数で済んだ。当該助成金は請求した助成金と合わせ、次年度に消耗品および実験動物飼育管理費として使用する予定である。

  • 研究成果

    (17件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (13件) 図書 (2件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Ribavirin inhibits Zika virus (ZIKV) replication inハvitro and suppresses viremia in ZIKV-infected STAT1-deficient mice.2017

    • 著者名/発表者名
      Kamiyama N, Soma R, Hidano S, Watanabe K, Umekita H, Fukuda C, Noguchi K, Gendo Y, Ozaki T, Sonoda A, Sachi N, Runtuwene LR, Miura Y, Matsubara E, Tajima S, Takasaki T, Eshita Y, Kobayashi T
    • 雑誌名

      Antiviral Research

      巻: 146 ページ: 1-11

    • DOI

      10.1016/j.antiviral.2017.08.007.

    • 査読あり
  • [学会発表] T細胞特異的TRAF6欠損マウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症が抑制される2018

    • 著者名/発表者名
      Naganori Kamiyama, Benjawan Saechu, Shinya Hidano, Kei Watanabe, Hidekazu Matsuoka, Kaori Noguchi, Yoshiko Gendo, Takashi Ozaki, Akira Sonoda, Nozomi Sachi, Yuki Eshita, Takashi Kobayashi
    • 学会等名
      第4回病因研究会別府シンポジウム
  • [学会発表] Development of reliable LAMP systems for Chikungunya virus and Leishmania2018

    • 著者名/発表者名
      Naganori Kamiyama, Benjawan Sae-chue, Yinan Wang, Akinaga Kusano, Nozomi Sachi, Shinya Hidano and Takashi Kobayashi
    • 学会等名
      第11回寄生虫感染免疫研究会
  • [学会発表] Analysis of a fluorescent material in Anisakis larvae.2018

    • 著者名/発表者名
      Shinya Hidano, Tadashi Kondo, Kazuhiro Mizukami, Makoto Nakatani, Naganori Kamiyama, Nozomi Sachi, Kazunari Murakami, Osamu Hirose and Takashi Kobayashi
    • 学会等名
      第11回寄生虫感染免疫研究会
  • [学会発表] Ribavirin inhibits Zika virus (ZIKV) replication in vitro and suppresses viremia in ZIKV-infected STAT1-deficient mice2017

    • 著者名/発表者名
      Naganori Kamiyama, Ryusuke Soma, Shinya Hidano, Benjawan Saechue, Nozomi Sachi, Kaori Noguchi, Takashi Ozaki, Akira Sonoda, Yoshiko Gendo, Yuki Eshita, and Takashi Kobayashi
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] アストロサイトのSTAT1シグナルは、トキソプラズマ脳炎のコントロールに重要である。2017

    • 著者名/発表者名
      Shinya Hidano, Christoph Konradt, Daniel P. Beiting, Lothar Hennighausen, Serge Fuchs, Anita A. Koshy, Naganori Kamiyama, Takashi Kobayashi and Christopher A Hunter.
    • 学会等名
      第86回 日本寄生虫学会大会
  • [学会発表] ヒト感染アニサキス症における種の同定と臨床症状との関連の検討2017

    • 著者名/発表者名
      水上一弘、飛騨野真也、伊藤秀幸、神山長慶、相馬 渉、阿部寿徳、勝田真琴、安部高志、永井敬之、後藤康彦、井上邦光、大場一生、卜 部繁俊、吉田 亮、大仁田賢、安部高志、永井敬之、後藤康彦、井上邦光、大場一生、卜部繁俊、吉田 亮、大仁田賢、村上和成、小林隆 志
    • 学会等名
      第86回 日本寄生虫学会大会
  • [学会発表] トキソプラズマ脳炎におけるアストロサイトの感染防御機構の解明2017

    • 著者名/発表者名
      飛彈野真也, Christoph Konradt, Daniel P. Beiting, 神山長慶, 小林隆志、Christopher A Hunter.
    • 学会等名
      第25回分子寄生虫学ワークショップ
  • [学会発表] アストロサイトのSTAT1シグナルは、トキソプラズマ脳炎のコントロールに重要である2017

    • 著者名/発表者名
      Shinya Hidano, Christoph Konradt, Daniel P. Beiting, Lothar Hennighausen, Serge Fuchs, Anita A. Koshy, Naganori Kamiyama, Takashi Kobayashi and Christopher A Hunter.
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] Inhibition of TLR9-induced dendritic cell activation and pro-inflammatory cytokine production by Oleoylethanolamide, whose level is reduced in MRL/lpr mice2017

    • 著者名/発表者名
      尾崎貴士, 園田光, 玄同淑子 , 野口香緒里, 佐知望美, 神山長慶 , 飛彈野真也 , 石井宏治 , 柴田洋孝 , 小林隆志
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] 新規脂質メディエーターのOEA及びPEAは、Toll様受容体9(TLR9)刺激による樹状細胞とB細胞の活性化を抑制する2017

    • 著者名/発表者名
      尾崎貴士, 後藤 亮, 園田光, 広瀬 晴奈, 玄同淑子, 野口香緒里, 神山長慶, 飛彈野真也, 石井宏治, 柴田洋孝, 小林 隆志
    • 学会等名
      第8回 癌・炎症と抗酸化研究会(CIA研究会)
  • [学会発表] Analysis for the induction and pathophysiological role of CCL20 in the intestinal tissue2017

    • 著者名/発表者名
      Nozomi Sachi, Shinya Hidano, Naganori Kamiyama, Kaori Noguchi, Takashi Ozaki, Akira Sonoda, Yoshiko Gendo, Takashi Kobayashi
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] combined administration of ampicillin and villlcomycin induces mild colitis with decreased diversity of gut microbiota and perturbation of glutamine and short chain fatty acid metabolisms.2017

    • 著者名/発表者名
      A.Sonoda,N.Sachi,Y.Gendo,T.0zaki,N.Kamiyama,S.Hidano,K.Mizukami,T.0kimoto,K.Murakami,T.Kobayashi
    • 学会等名
      25th United European Gastroenterology Week
  • [学会発表] アンピシリンとバンコマイシンの投与によってグルタミン酸代謝と短鎖脂肪酸の発酵が障害され、マウス腸炎が誘発される。2017

    • 著者名/発表者名
      園田光、玄同淑子、尾崎貴士、佐知望美、飛彈野真也、神山長慶、村上和成、小林隆志
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [図書] 臨床免疫・アレルギー科2017

    • 著者名/発表者名
      神山長慶、佐知望美、飛彈野真也、小林隆志
    • 総ページ数
      7
    • 出版者
      科学評論社
    • ISBN
      1881-1930
  • [図書] 医学と薬学2017

    • 著者名/発表者名
      飛彈野真也、水上一弘、、佐知望美、神山長慶、小林隆志
    • 総ページ数
      6
    • 出版者
      自然科学社
    • ISBN
      0389-3898
  • [産業財産権] ジカウイルス感染症治療用医薬組成物2017

    • 発明者名
      小林隆志、神山長慶、相馬颯介、飛彈野真也
    • 権利者名
      国立大学法人大分大学
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2017-108007

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公開日: 2018-12-17  

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