| 研究課題/領域番号 |
17K17558
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
大庭 賢二 自治医科大学, 医学部, 講師 (20759576)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | HPV / 発がん初期 / 細胞競合 / 感染防御・制御 / 細胞間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
研究計画に基づいて研究を遂行し、以下に示す進捗・結果が得られた。
細胞競合条件下でテトラサイクリン誘導性HPV E6発現細胞に誘導されるアポトーシスを介した排除機構の解析を行うために、テトラサイクリン刺激から16時間後の細胞群をEGFP-E6の蛍光を利用したCell sortingによって、E6発現細胞を細胞競合条件下から分離した。その後、次世代シークエンスによりRNAシークエンス解析を行ったところ、約100種の遺伝子に発現上昇が、約80種の遺伝子に発現減少が生じていることが分かった。その中で、約10遺伝子がアポトーシスと何らかの関連がある遺伝子であった。
さらに、アポトーシスとの関連が強い3因子の関与を解析するために、E6発現細胞にそれぞれの遺伝子特異的なshRNAを導入し、細胞競合特異的なE6発現細胞の細胞死への影響を観察した。すると、それぞれの因子に対するshRNAの導入によってある程度アポトーシスが減少していることが分かった。アポトーシスの減少度が大きかった1種の遺伝子は生体防御反応時に放出される因子によって惹起される遺伝子であった。
そこで、生体防御反応で放出される因子が刺激するプロモーター活性をルシフェラーゼレポーターを用いて解析したところ、正常細胞やE6発現細胞の単独培養ではあまり活性化しておらず、細胞競合条件下特異的にE6発現細胞内においてプロモーター活性が上昇していることが分かった。
分子機構の解析に加えて、HPVに対する細胞競合をin vivoで解析するためのモデルマウスの構築を行った。Rosa26にCre酵素特異的に組換えを誘導できるEGFP, E6, E7, E6/E7遺伝子を発現できるベクターを構築し、マウスES細胞を樹立した。その後にそれらのES細胞を用いて第一世代のマウスの構築を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に基づき、E6発現細胞に対する細胞競合の分子機構の解析としてE6発現細胞に対するRNAシークエンスを実施し、細胞競合特異的に発現上昇・減少する約180種の因子を同定した。その中で、細胞競合時に起こるE6発現細胞特異的なアポトーシスに関わる10種の因子を同定し、アポトーシスに強く関与する3因子については特異的なshRNAの導入によりアポトーシスが減少した。以上より、同定された因子が細胞競合特異的なE6発現細胞のアポトーシスを介した排除機構に関与していることが確認された。さらに、1つの因子は生体防御反応時に放出される因子によって誘導されている事が示唆され、その因子によって刺激されるプロモーターがレポーターアッセイよって確かに細胞競合特異的にE6発現細胞で活性化している事が示唆された。
加えて、共焦点顕微鏡を用いた1細胞サンプリングシステムを用いた解析を開始した。当初は質量分析を行う事にしていたが、感度やサンプル量の問題から1細胞サンプリングシステムを用いたRNAシークエンス解析へと変更した。条件検討が概ね完了し、細胞競合条件下でE6発現細胞を取り囲む正常細胞を1細胞ずつサンプリングすることが可能になった。また、１細胞からcDNAの合成にも成功し、細胞競合下の任意の細胞の1細胞RNAシークエンスが行える可能性を示すことができた。
ランダムライブラリーを用いた解析は高価であるために実施が難しいと判断し、代替として細胞競合時の細胞表面因子の変化をスクリーニングできる系の立ち上げを試みた。
さらに、in vivo解析系の構築のためにモデルマウスの作製を行った。Rosa26にCre酵素特異的に組換えを誘導し、E6/E7遺伝子を発現できるベクターによってES細胞を樹立し、第一世代のマウスの作出を行った。
以上のように、多少の研究計画の変更はあるものの、研究は概ね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度からの継続として、HPV E6/E7発現細胞に細胞競合特異的に誘導される細胞死（アポトーシス）の分子機構の解析を行っていく。
具体的には、RNAシークエンスによってE6発現細胞のアポトーシスに関与すると確認された因子とその近傍の分子メカニズムの解析を行っていく。また、新たに立ち上げた1細胞RNAシークエンスによる解析、ならび細胞競合特異的な細胞表面因子の変化を同定するスクリーニングも行っていく。これらの解析を通して、HPV E6/E7発現細胞に細胞競合特異的に誘導される細胞死（アポトーシス）の分子機構の全容解明を目指していく。
またin vivoでの解析のために、HPV E6/E7感染疑似モデルマウスの構築を継続し、細胞培養系で証明された分子機構をin vivoでも証明することを目指していく。
しかしながら、申請時とは異なり研究代表者が他機関に異動したことから、新たに実験系を移設・構築するための時間が必要となるため、申請書に記載した研究計画通りに最終年度は進まない可能性がある。そこで、研究の進捗状況に応じて実験方針の変更や解析内容の選択・集中を行うなどによって臨機応変に対処し、論文化を含めて最適な研究計画の達成プランを再構築しながら、研究を遂行していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度の物品購入額は若干、予定よりも少ないものの概ね当初の予定通りの執行状況である。しかし研究代表者が当該年度中に異動し、新たな環境でのセットアップが必要になるため、多少の支出は抑えて執行した。また、異動にともなって当初計画をしていた海外学会を含めた学会参加などを行うことが出来なくなってしまったため、特に旅費分で当初の予定よりも支出が減った。
次年度は研究計画最終年度であり、異動先で研究計画を達成するための研究環境を早急に整えるため、次年度繰越金を含めて積極的に予算を使用していく。そして研究環境を整えた上で前年度までに行っていた解析を継続、ならびに最終年度に計画していた研究を執り行い、年度末までに申請書に記していた研究計画の達成を目指していく。
また、国内外の学会参加を積極的に行うことや研究内容の論文化に関わる準備などにも予算を積極的に使用して行き、研究成果の対外的な公表にも力を入れて最終年度の研究を履行していく。
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