| 研究課題/領域番号 |
17K17636
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
神田 真人 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (50444055)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 心筋再生 / 細胞移植療法 / 心筋梗塞 / 褐色脂肪組織 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は心筋特異的多蛍光発色マウスマウスモデル(Rainbow-Cre マウス)を用いて、MI後に褐色脂肪組織(BAT)細胞の移植療法等を行い、それらによる心筋細胞分裂促進作用を調べる。さらに、再生出現部位を特異的に採取・解析することで新規心筋再生促進因子を同定し、あらたな再生医療につなげることを目的とする。平成29年度にはRainbow-Creマウス(Rb/Cre遺伝子)のRb/Rbホモ体を作成し、心筋梗塞(MI)群でsham群に比べ、再生頻度が増加していることを確認している。平成29年度から30年度にかけては、このマウスへの細胞移植療法を確立した。褐色脂肪粗機(BAT)細胞を、マウスの背部、および腋窩部より採取、増殖因子の入ったメソカルト等とともに10-14日培養し、その後いったん分離し、PuraMatrixとあわせて3次元培養を行った。MIを作成したモデルマウスを2-4週間後に再度胸腔を解放して、心筋梗塞ができていることを確認後、上記のBAT+ PuraMatrixT M移植群とVehicle単独移植群にわけ、移植処置を安定して行えるようになった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価では移植群で、コントロール群に比較して、心臓のリモデリングを抑制し、心機能を保持している傾向を確認した。この手法を上記Raibow-Creマウスに適応し、安定して心筋組織切片を得ることができた。この切片においても増殖マーカーによる免疫染色では難しかった、cytokinesis
まで完遂した完全な増殖部位および頻度を探知できることを確認しており、心筋梗塞部位周辺で増加傾向であることを観察している。今後モデル数を増やして解析予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Rainbow-CreマウスRb/Rbのホモ体を安定的に産出させ、Tamoxifen投与後ランダムに6色の蛍光発色を観察するモデルを確立した。また、BAT細胞の採取・3次元培養の手技も確立し、安定的に施行可能となった。MIを作成したモデルマウスを2-4週間後に再度胸腔を解放して、心筋梗塞ができていることを確認後、上記のBAT+ PuraMatrixT M移植群とVehicle単独移植群にわけ、移植処置を安定して行えるようになった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価も確立し、移植群で、コントロール群における心機能の違いについて確認できるようになった。そこでMIおよび慢性期の移植治療の手技をRainbow-Creマウスに施行した。Rainbow-Creマウスの心臓は切片を作成しており、再生増殖部位の撮影・解析を現在施行している状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記モデルが確立したため、Rainbow-Creマウスにおける慢性期の移植治療による心筋再生の促進効果およびそのメカニズムについて検討していく。BAT細胞に分裂・増殖促進作用があることがわかったら、モデルマウスに於いて分裂・増殖部位を特異的に採取する。 まず、慢性期心不全モデルにおいてBrdU・Ki67・AuroraBなどの従来のマーカーを用いて、最も分裂が進んでいる時期を同定する。次に同定した分裂期において、発現因子している因子を比較し、心筋分裂誘導候補因子を選別する。候補因子の中からin silico、およびqRT-PCRによる絞り込みを行う。絞り込んだ因子を成体マウスから採取した培養心筋細胞に投与し、増殖促進効果について細胞増殖マーカー等により検証し、もっとも効果のあるものを同定する。さらに同定された新規因子については、in vivoでの分裂誘導効果を評価する。促進因子の増産のために、cDNAの形でプラスミドに導入したあと、大腸菌を用いて増殖・精製を行い、マウスにプラスミドの形でトランスフェクションする、もしくはベクターウイルス等を用いて導入する。M後慢性心不全期に心機能改善効果をみると同時に、心筋分裂促進作用をこれまでと同じ手法で評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度はBAT細胞の採取・3次元培養およびその慢性心不全モデルへの移植手技も確立したが、その後は心エコーやMRIによる心機能評価の確立に時間をかけたため、当初の設定より費用がかからなかった。今後は、上記マウスに移植療法を行うために、大量のBAT細胞の培養が必要になる。さらにマウスの心筋切片の中から増殖部位を採取して、RNAシーケンサーまで委託する必要があり、次年度に支出が増加すると考えられる。
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