| 研究課題/領域番号 |
17K17719
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
半田 哲也 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 特任助教 (40772570)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ヒストン修飾 / 遺伝子発現制御 / クロマチン / エピジェネティクス / 生細胞イメージング / エピゲノム操作 / CRISPR/Cas |
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| 研究実績の概要 |
ヒストンの翻訳後修飾は遺伝子発現制御に重要な役割を果たしており、細胞の形質発現制御の基盤として働いている。本研究は、従来の細胞を固定するようなスナップショット的な解析では明らかにできていない、環境応答や細胞分化の際に、クロマチン構造がどのように変化し、遺伝子発現が制御されているのかという問題に挑む。本年度は熱ショック応答での転写活性化に着目し、研究室独自の翻訳後修飾可視化系に、CRISPR/Cas9を応用した特定ゲノム領域の可視化技術とヒストン修飾の人為的操作を組み合わせることで、生きた細胞内でクロマチン構造の変化と遺伝子発現の動態を明らかにすることを目指した。HSF1は熱ショックにより活性化し、標的遺伝子の転写を誘導する。ヒトではHSF1結合配列が、Satellite 3 (Sat3)リピート配列内にも存在し、熱ショックに応答してSat3 RNAの転写が観察される。生細胞イメージング計測の結果、Sat3では熱ショックに応答したRNAPol2活性化に先立ってヒストンH3 Lys9、H3 Lys27のアセチル化(H3K9ac、H3K27ac)が上昇した。RNA Pol2活性化を阻害した場合にもH3K27acは上昇したことことから、先行して独立に起こるヒストンのアセチル化が転写活性化に重要であることが示唆された。次に、ヒストンアセチル化酵素の１つであるp300の酵素活性ドメインをdCas9に融合することで、Sat3領域のH3K27acレベルが上昇し、熱ショック前からSat3転写が亢進していた。一方、ヒストン脱メチル化酵素のKDM4DをdCas9に融合することで、Sat3領域のH3K9メチル化レベルを減少させると、熱ショック時のSat3転写量が増加した。このことから、H3K27acはRNAPol2の活性化を促進し、H3K9メチル化は転写レベルの上限を規定していると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CRISPR/dCas9によるゲノム領域の可視化、およびエピゲノム操作において、現在のコンストラクトでは蛍光強度が弱く、長時間での生細胞イメージングが困難である。生細胞イメージング計測によるダイナミクス解析を行うためには、dCas9に付加する蛍光タンパク質の変更・追加、guide RNAをaptamerとする蛍光シグナルの増幅系を検討する必要があると考えられる。また、RNAをターゲットとするclass 2 type VI CRISPR/Casシステムを応用することで、内在性RNAの生細胞イメージング系の構築に取り組んでいる。Leptotrichia shahii (Lsh)由来のCas13aに、酵素活性失活変異を導入し、sfGFPを融合した発現系(dLshCas13a-sfGFP)を構築し、Sat3 RNAをターゲットとするLshのguide RNAとともに発現させ、熱ショック時の生細胞イメージングを行ったところ、一部の細胞で、HSF1の集積箇所にdLshCas13a-sfGFPの共局在が観察された。しかし、dLshCas13a-sfGFPタンパク質が細胞質や核小体にドミナントに存在するため、核内でのターゲティング分子の識別が難しい。これを克服するために、NLSの追加、他のCas13オーソログの検討など、内在性RNAの生細胞イメージングに適したCRISPR/dCas13システムの構築を行う必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR/dCas9によるゲノム領域の可視化、エピゲノム操作を施した細胞を用いて生細胞イメージング計測を行うために、安定発現細胞の構築を進める。この過程で、dCas9に融合する蛍光タンパク質を検討し、さらにguide RNAをaptamerとする蛍光シグナルの増幅系を検討する。生細胞イメージングに適した細胞が得られたら、FabLEMやmintbodyを用いた翻訳後修飾可視化系を組み合わせ、ヒストン修飾やRNAPol2のリン酸化修飾の動態を解析する。また、基本転写因子についても蛍光融合タンパク質として発現させることで、転写活性化における動態を明らかにする。さらに、dCas9にヒストンシャペロンなどを機能付加することで、転写制御におけるヒストン交換の計測と、その意義について解析を行う。次に、効率の良い内在性RNA生細胞可視化系を構築するために、最近報告されたCas13の比較解析を参考に、Leptotrichia wadeiやRuminococcus flavefaciens由来のCas13タンパク質に、酵素活性の失活変異、蛍光タンパク質の融合を行い、まずは熱ショック時のSat3 RNA可視化を検討する。哺乳類の雌の体細胞では、遺伝子量補正のために、2本あるX染色体のうち片方の転写が不活性化されている。分化過程で、片方のX染色体から非コードRNAであるXistが発現し、そのX染色体全体を覆い、H3K27トリメチル化など、ヒストン修飾を介して、高度に凝集したゲノム3次元構造をとるようになる。この不活性X染色体（Xi）形成過程における、Xsit RNAの挙動、ヒストン修飾やクロマチン構造がどのように変化していくのかについて理解するために、Xist RNAの可視化系を構築し、さらに、ヒストン修飾やRNAPol2のリン酸化修飾の観察を組み合わせて解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
生細胞イメージングを行うための安定発現細胞株の所得に時間を要したため、実際の翻訳後修飾の可視化を行うために必要な抗体精製試薬類、標識用の蛍光試薬などの消費が少なかった。当初予定していた画像解析用のワークステーションの購入について、研究室で共用のハイスペックのものが導入されたため、代わりにモバイルPCを購入し、併用することで作業の効率化を図ることができた。次年度には、セルソーター等を使用することで、細胞株の取得がより効率的に進むと考えられ、イメージングに必要な試薬類の消費が大きく増えることが見込まれる。
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