| 研究課題/領域番号 |
17K17795
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
入江 克雅 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 助教 (20415087)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / X線結晶構造解析 / イオン選択性 / 電気生理学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、電気生理学的手法による活性測定とX線結晶構造解析による高分解能の構造情報を組み合わせることによるNavのNaイオン選択的な透過機構の解明を目指している。該当年度において申請者は主に以下の二点を行った。
まず、原核生物由来ナトリウムチャネルの一種であるNavAbのイオン選択性フィルターを構成する残基へ変異導入を行いチャネル活性が消失するあるいはイオン選択性が変化する変異を複数種同定した。活性消失の変異は選択性フィルターの細胞内領域に近いロイシン残基への変異であり、嵩高い疎水性残基への変異により活性が消失した。また、イオン選択性を変える変異は細胞外側のセリン残基への変異であり、小さい側鎖の残基への変異によりLiイオンの透過性が増加することを明らかにした。
そこで、これらの変異体の発現・精製及び結晶化を行った。野生型とほぼ同等の結晶化条件で単結晶が得られ、活性が消失する変異体について3.5Å分解能程度の回折データを収集し構造決定に成功した。これにより、変異導入による構造変化を明らかにした。活性失活変異体では嵩の高い残基への変異導入によりイオンポアの内径が狭まっており、イオン透過に必須なポア内径が予想された。予想される内径からNaイオンの透過時における脱水和は部分的であることが示唆され、このことはこれまでの研究で明らかになった選択性フィルター内の非対称なNaイオンの電子密度が示唆する透過機構にも一致する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成29年度の計画として、透過活性に影響のある変異体の同定を掲げていた。この実験計画に沿って、失活変異や選択性が変化する変異体を複数取得しており、さらには、Liイオン選択性を高める変異を同定することができた。Liイオンに高い選択性を持つイオンチャネルはこれまでに同定されておらず、変異体としても高いLiイオン選択性を持つチャネルの創製は産業界や環境浄化への大きな波及効果が期待できる。また、これらの変異体のうち結晶化条件が野生型に近いものについては構造取得に成功している。以上のことから、当初の計画以上に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに同定したチャネル活性が変化する変異体のホモ四量体でのX線結晶構造解析を進め変異による構造変化を明らかにする。特にLiイオンの透過性が増す変異体については水和イオンとの相互作用が観測可能な高分解能での構造を決定する。高いNaイオン選択性を持ち非対称なイオンポアの構造決定に向けて、NavAbの四つのサブユニットを一本のポリペプチド鎖で繋いだタンデム四量体に変異導入し変異残基を多く持ちNaイオン選択的な透過活性を維持する非対称なフィルター配置を決定する。決定した非対称フィルターを持つタンデム四量体の精製条件を検討する。
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