| 研究課題/領域番号 |
17K17812
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
渡邊 直希 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 助教 (60769339)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アルツハイマー病 / 遺伝子発現制御 / 脳神経疾患 / 老化 / 神経科学 / ILEI / Amyloid-β / γ-Secretase |
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| 研究実績の概要 |
我々は脳内Aβ産生を抑制するタンパク質としてILEI/FAM3Cを同定し、老化やアルツハイマー病(AD)では脳内発現が負に制御されることを示してきた。本研究では、ADの基本病態である脳内Aβ蓄積をきたす一次的原因を解析し、発症前診断法や先制治療法の開発に資することを目的としている。
①加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明 [1-1]ILEI遺伝子の転写調節領域解析：ヒトILEI遺伝子転写開始点上流約8kbをクローニングし、Luciferaseレポーターアッセイで解析した。転写開始点上流から段階的に短縮し、さらに領域を区切り、領域特定を進めたところ、転写開始点上流約-49bp～-20bpに顕著な転写活性が認められた。[1-2] 転写因子アレイによるILEI転写因子の同定：神経系細胞株SH-SY5YでILEI発現抑制性候補因子GSP2、DMAP1、RNF2、TAF5のsiRNAによるノックダウンを実施し、ILEI発現を解析したが、ILEIの発現変化は認められなかった。
②脳内ILEI発現レベルの減少がAD発症のリスク因子となることの検証 [2-1]ILEI-floxedマウスの作製： ILEI遺伝子の開始コドンを含むエクソン2を挟む形でloxP配列を挿入し、Creリコンビナーゼによる組換え後にILEIが正常に翻訳されないように設計したターゲティングベクターを作製した。ジーンターゲティング法によりES細胞へLoxPサイトを導入し、ILEI-floxed ES細胞を用いてキメラマウスを作製する方法で、ILEI-floxedキメラマウスを得た。
③脳内ILEIレベルが発症前ADのバイオマーカーとして成立することの検証 [3-1]高感度ILEI定量系の構築： 2種のモノクローナル抗ILEI抗体を作製し、髄液等で高感度測定可能なサンドウィッチELISA定量系を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①加齢に伴う脳内ILEI発現低下のメカニズム解明
[1-1]ILEI遺伝子の転写調節領域解析：BACからヒトILEI遺伝子転写開始点上流8.8kbゲノム領域をクローニングし、Lucレポーターアッセイにより解析した。細胞としては、非神経系HEK293、神経系SH-SY5Y、マウス初代培養ニューロンを用いた。転写開始点上流から段階的に短縮したところ、-87bpから下流の領域に顕著な転写活性があることが示唆された。一方、上流領域を約1kbずつに区切り、さらに領域を絞ったところ、-3095～-3058bp、-2976～-2940bp、-1044～-1002bpおよび-114～-1 bpに転写活性が認められたが、これらの領域を欠損させて転写活性が低下したのは-114～-1 bpのみであった。これらを総合し、領域特定を進めたところ、転写開始点上流約-49bp～-20bpに顕著な転写活性が認められた。以上については、細胞種による明らかな差異は認めなかった。
②脳内ILEI発現レベルの減少がAD発症のリスク因子となることの検証
[2-1]ILEI-floxedマウスの作製：マウスILEI遺伝子の開始コドンを含むエクソン2を挟む形でloxP配列を挿入したターゲティングベクターを作製した。ジーンターゲティング法によりES細胞へLoxPサイトを導入し、スクリーニングにより得られたILEI-floxed ES細胞を用いてキメラマウスを作製したところ、毛色キメラ率の高いILEI-floxedキメラマウスを3系統得た。
③脳内ILEIレベルが発症前ADのバイオマーカーとして成立することの検証
[3-1]高感度ILEI定量系の構築：作製した2種のモノクローナル抗ILEI抗体を用い、脳髄液、脳実質溶解液、HEK293細胞培養上清で条件検討を行い、ng/mLのレベルまで測定可能なELISA定量システムを構築した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ILEI転写開始点上流の顕著な転写活性領域が絞れてきたので、前年度に続き、ILEI転写因子の同定を進める。転写因子モチーフデータベースと照合し解析を進めたところ、転写因子の候補の一つとしてSMAD1が挙がっており、まずこの因子について解析を進める。ニューロンやグリア細胞等の細胞種毎の発現の違いから、細胞種特異的な転写制御機構を調べる。ILEIのin vivo発現パターンや老化やADに伴う発現減少のメカニズムについて検討を進める。
ILEI-floxedキメラマウスについては、germline transmissionが起きているかを次世代のマウス産仔で確認する。確認できない場合には、別クローンのES細胞のマイクロインジェクションを再度実施する。それでもfloxedマウスが得られない場合には、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムによりIn/Del型ノックアウトマウスを作製する。
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