| 研究課題/領域番号 |
17K17814
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
岩崎 広高 滋賀医科大学, 医学部, 特任助教 (40781589)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | p300 / 2a型筋線維 / miR-494 / ヒトiPS細胞 / 骨格筋分化 |
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| 研究実績の概要 |
筋線維の組成が、生活習慣病や筋疾患、加齢と密接に関係していることがわかってきているが、筋ファイバータイプ決定のメカニズムについては不明な点も多い。本研究の目的は、ヒトiPS 細胞由来骨格筋では筋線維タイプ形成を制御するmiR-494 が生体内でどのような働きを担っているかについて検討し、生活習慣病や筋疾患の治療薬開発につなげることである。
平成29 年度には、ヒトiPS 細胞の筋分化過程におけるmiR-494 の標的遺伝子を明らかにした。また、miR-494 ノックアウトマウスを作製した。
具体的には、miR-494 によって発現が変化する標的遺伝子を探索する目的で、①未分化なiPS 細胞、②MyoD強制発現により作製したmyoblast、③miR-494 に対するmature oligonucleotideをMyoDにより骨格筋に誘導したiPS 細胞にtransfectionを行い作製したmyoblast において、micro array (TaKaRa 社Agilent Certified)でmiR-494 transfection 群で発現量が低下している遺伝子のスクリーニングを行った。次に複数のmicroRNA target scan サイトを用いて、miR-494特異的な3’非翻訳領域を有する遺伝子を同定し、RT-qPCR法、Western blot 法にて発現量の確認を行った。その結果、miR-494が転写共役因子p300を介して2a型筋線維を制御することがわかった。この成果によって、筋ファイバータイプ決定メカニズムの一端が明らかとなった。
また、生体内でのmiR-494の働きを検討するために、筑波大学に依頼しCRISPR-Cas9を用いてmiR-494ノックアウトマウスを作製することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成29年度の計画では、まず第一にヒトiPS 細胞の筋分化過程におけるmiR-494の標的遺伝子を明らかにすることが目的であった。結果、miR-494の直接標的遺伝子として転写共役因子p300を同定し、ヒト筋ファイバータイプ形成メカニズムの一端を明らかにすることができた。
また、miR-494ノックアウトマウスを作製する計画では、当初ES細胞を用いて作製する予定であった。しかし、時間がかかり、成功率も低いため、近年急速に普及してきたCRISPR-Cas9を用いてmiR-494ノックアウトマウスを作製する方針に変更した。その結果、平成29年度中に作製することに成功し、現在繁殖を行っている段階であり、ほぼ当初の計画通りにすすんでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30 年度には、まず、運動によるミトコンドリア増加におけるmiR-494 の役割を明らかにする。また、miR-494 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをマウス骨格筋に注射し、miR-494 が後天的にミトコンドリア発現や、筋ファイバータイプ、運動耐容能、糖代謝に与える影響を検討する。
さらに、miR-494ノックアウトマウス繁殖の進行状況で、miR-494ノックアウトマウスの筋ファイバータイプ、骨格筋のミトコンドリア、運動耐容能、糖代謝を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
miR-494ノックアウトマウス作製に必要な予算が当初の計画より少なかったため、次年度使用額が生じた。
翌年度分として申請した助成金と合わせた使用計画として、miR-494全身ノックアウトマウスのみならず、miR-494骨格筋特異的ノックアウトマウス、脂肪細胞特異的ノックアウトマウス、褐色脂肪細胞特異的ノックアウトマウスを作製し、骨格筋および、骨格筋と同じ間葉系幹細胞由来である脂肪組織におけるmiR-494の詳細な機能解析をすすめる。
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