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2017 年度 実施状況報告書

有用物質高生産のための酵母バイオセンサの開発とその応用

研究課題

研究課題/領域番号 17K17878
研究機関神戸大学

研究代表者

中村 泰之  神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 学術研究員 (40733184)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2019-03-31
キーワード酵母 / バイオセンサ / シグナル伝達 / Gタンパク質共役型受容体 / メラトニン / レポーター遺伝子
研究実績の概要

本研究では、目的物質の合成代謝経路を導入した酵母での物質生産性の向上を目的として、バイオセンサを利用することにより、様々なライブラリの中から有用物質高生産株をスクリーニングするためのシステムを開発することを研究目的とする。
平成29年度は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を利用して目的物質であるメラトニンのバイオセンサを構築し、メラトニンの濃度に応じて酵母細胞がセンシングを行うシステムの開発を行った。GPCRの一種であるヒト由来メラトニン受容体を酵母の細胞膜表面に発現させることで酵母内在性のシグナル伝達経路と共役してメラトニンの結合を感知できるレポーター発現系を構築することにした。その結果、メラトニン濃度に依存したレポーター発現強度の違いを示すことができた。
さらにメラトニン高生産株をスクリーニングするためには、バイオセンサの測定可能濃度域が調節可能なシステムの構築が必要である。そこで、バイオセンサの感度調節を可能にするために、バイオセンサであるGPCRの種類を変えたり、強度の異なるプロモーターを用いることで発現量をコントロールし、GPCRを高発現にすることで高感度バイオセンサを構築し、低発現にすることで低感度バイオセンサの構築に成功した。また、GPCRのGタンパク質と相互作用する部位に変異を導入することでGPCRの感度調節を行うことにも成功した。このことから、受容体の発現量や親和性を改変することでメラトニン濃度の検出感度を人為的に調節可能であることを実証した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成29年度の研究計画通りに、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を利用して目的物質であるメラトニンのバイオセンサを構築し、メラトニンの濃度に応じて酵母細胞がセンシングを行うシステムの開発に成功した。さらに、受容体の発現量や親和性を改変することでメラトニン濃度の検出感度を人為的に調節可能であることが示されたことから、メラトニン高生産株をスクリーニングするために必要であると考えているバイオセンサの測定可能濃度域が調節可能なシステムの構築に成功した。これらのことから、研究はおおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

今後は変異酵母株ライブラリからの高生産株のスクリーニングを実施していく。UV変異や薬剤変異導入により、ゲノム全体にランダムに変異を導入したライブラリから、開発したスクリーニングシステムによりメラトニン高生産株のスクリーニングを行う。選抜された高生産株の生産能を評価するとともに、取得した変異株を次世代シーケンサーによりシーケンスして変異導入部位を同定することを検討している。

次年度使用額が生じた理由

(理由)研究補助員の雇用を想定していたが、適任者が見つからず雇用が叶わなかったため。なお当該年度は研究開発が順調に進んだため、研究代表者及び研究協力者で計画を遂行することができた。
(使用計画)次年度の直接経費(物品費)として使用するとともに、研究補助員の雇用における人件費として使用する。今後は作業従事者を増員することで、研究計画の進行を加速することが期待できる。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 4件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Modifying Expression Modes of Human Neurotensin Receptor Type 1 Alters Sensing Capabilities for Agonists in Yeast Signaling Biosensor2018

    • 著者名/発表者名
      Hashi Hiroki、Nakamura Yasuyuki、Ishii Jun、Kondo Akihiko
    • 雑誌名

      Biotechnology Journal

      巻: 13 ページ: e1700522

    • DOI

      10.1002/biot.201700522

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Biosensing techniques in yeast: G-protein signaling and protein-protein interaction assays for monitoring ligand stimulation and oligomer formation of heterologous GPCRs2018

    • 著者名/発表者名
      Nakamura Yasuyuki、Kondo Akihiko、Ishii Jun
    • 雑誌名

      IntechOpen, Peripheral Membrane Proteins

      巻: - ページ: 25-48

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Positive Feedback Genetic Circuit Incorporating a Constitutively Active Mutant Gal3 into Yeast GAL Induction System2017

    • 著者名/発表者名
      Ryo Shintaro、Ishii Jun、Matsuno Toshihide、Nakamura Yasuyuki、Matsubara Daiki、Tominaga Masahiro、Kondo Akihiko
    • 雑誌名

      ACS Synthetic Biology

      巻: 6 ページ: 928-935

    • DOI

      10.1021/acssynbio.6b00262

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 低分子抗体医薬の開発展望2017

    • 著者名/発表者名
      中村泰之、伊藤洋一郎、梅津光央、石井純、近藤昭彦
    • 雑誌名

      バイオインダストリー

      巻: 34 ページ: 54-62

  • [学会発表] A new autonomous replicating plasmid vector containing Pichia pastoris centromeric DNA2018

    • 著者名/発表者名
      Nakamura Yasuyuki、Nishi Teruyuki、Noguchi Risa、Ito Yoichiro、Watanabe Toru、Nishiyama Tozo、Aikawa Shimpei、Hasunuma Tomohisa、Ishii Jun、Yasohara Yoshihiko、Kondo Akihiko
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Innovative BioProduction Kobe
    • 国際学会
  • [学会発表] Development of G-protein-coupled receptor (GPCR)-based metabolite sensor for monitoring physiological chemical melatonin in eukaryotic yeast cells2018

    • 著者名/発表者名
      Tabata Takuya、Nakamura Yasuyuki、Kondo Akihiko、Ishii Jun
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Innovative BioProduction Kobe
    • 国際学会
  • [学会発表] Enhanced protein secretion by accumulation of novel effective factors in Pichia pastoris2018

    • 著者名/発表者名
      Ito Yoichiro、Nakamura Yasuyuki、Nishi Teruyuki、Aikawa Shimpei、Hasunuma Tomohisa、Ishii Jun、Kondo Akihiko
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Innovative BioProduction Kobe
    • 国際学会
  • [学会発表] A simple and efficient DNA multi-assemble method using episomal vector in Pichia pastoris2018

    • 著者名/発表者名
      Nishi Teruyuki、Tamai Masaya、Yamaji Taiki、Watanabe Toru、Nishiyama Tozo、Nakamura Yasuyuki、Ito Yoichiro、Ishii Jun、Kondo Akihiko、Yasohara Yoshihiko
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Innovative BioProduction Kobe
    • 国際学会
  • [学会発表] P. pastorisにおける自律複製型ベクターを用いた効率的なDNAマルチアセンブル法2018

    • 著者名/発表者名
      西輝之、山路大樹、玉井雅也、渡邉徹、西山陶三、中村泰之、伊藤洋一郎、石井純、近藤昭彦、八十原良彦
    • 学会等名
      第12回日本ゲノム微生物学会年会
  • [学会発表] 特定の生理活性物質を濃度依存的に感知する酵母メタボライトセンサの開発2017

    • 著者名/発表者名
      田畑琢也、中村泰之、石井純、近藤昭彦
    • 学会等名
      生物工学若手研究者の集い 夏のセミナー2017
  • [学会発表] Pichia pastorisにおけるセントロメア配列を含む自律複製型プラスミドの開発2017

    • 著者名/発表者名
      中村泰之、西輝之、野口理紗、伊藤洋一郎、渡邉徹、西山陶三、藍川晋平、蓮沼誠久、石井純、八十原良彦、近藤昭彦
    • 学会等名
      第69回日本生物工学会大会
  • [学会発表] Pichia pastorisのタンパク質分泌生産における有用因子の獲得とその蓄積による効果の検証2017

    • 著者名/発表者名
      伊藤洋一郎、中村泰之、西輝之、藍川晋平、蓮沼誠久、石井純、近藤昭彦
    • 学会等名
      第69回日本生物工学会大会
  • [学会発表] メラトニン濃度をモニタリングするための酵母in vivoメタボライトセンサ2017

    • 著者名/発表者名
      田畑琢也、中村泰之、石井純、近藤昭彦
    • 学会等名
      化学工学会 第49回秋季大会
  • [学会発表] ヒト由来生理活性物質を特異的に検知する酵母in vivoバイオセンサ2017

    • 著者名/発表者名
      田畑琢也、中村泰之、石井純、近藤昭彦
    • 学会等名
      神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会
  • [備考] 神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科バイオ生産工学研究室ホームページ

    • URL

      http://www2.kobe-u.ac.jp/~akondo/index.html

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公開日: 2018-12-17  

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