| 研究課題/領域番号 |
17K18002
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
長谷部 文人 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (30781801)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 微生物生産 / 生合成 / 生物有機化学 |
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| 研究実績の概要 |
2017年度は研究計画書の『②-3:Ornithine由来アルカロイドの醗酵生産』を達成するため、NicotineやTropinoneの共通中間体であるN-methyl-Δ1-pyrrolinium cation (N-mpyr)の微生物生産を試みた。
まず標品を得るために、4-Chlorobutanal diethyl acetalとmethylamineからN-mpyrの合成・単離・精製を行い、NMRおよびHRMSを用いてその構造を確認した。また、陽イオン交換カラムを用いることでN-mpyrを分析できる系を確立した。次に、Nicotiana tabacum 由来のPutrescine N-methyltransferase(PMT)とN-methylputrescine oxidase(MPO)のコドン最適化した合成遺伝子を購入し、大腸菌を用いて組換え酵素を取得した結果、PMTの反応の再現は取れたが、MPOの活性を検出することが出来なかった。そこで、MPOの代替となり得る酵素を探索し、基質特異性が寛容な大腸菌由来のPutrescine aminotransferaseであるYgjGに着目した。
YgjGの組換え酵素を取得し、In vitroを行い、HPLCで分析した結果、N-methylputrescineの消費とそれに伴うN-mpyrの生成、およびその逆反応が進行することが明らかになった。PMTとYgjGとを大腸菌を用いて共発現させ、その培養上清をHPLCに供した結果、PMTとYgjGを共発現した条件でのみN-mpyrのピークが検出され、N-mpyrの大腸菌を用いた微生物生産を達成できた。さらに、培養液にGlucoseを添加することでその生産量が増加することも見出した。
S-adenosyl-L-methionine合成酵素:MetKとOrnithine decarboxylase: SpeCをPMT、YgjGと共に強制発現させ、N-Mpyrの生産量を経時的に測定した結果、培養24 hから36 hにおいて野生株ではN-Mpyrの消費が観測された。N-Mpyrを消費し得る酵素の存在が示唆されたことから、対象酵素がプトレシン代謝系の酵素であると考え、これらの遺伝子ydcWとpuuCの二重破壊株を作製し、同様に培養した結果、その消費は解除されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2017年度はOrnithine由来アルカロイドの醗酵生産を主に取り組んだ。まずN-mpyrの標品を合成し、その分析系を確立出来た。次に既知の生合成経路の酵素であるPMTとMPOを共発現することでN-mpyrの生産を試みた。この際、MPOの活性が再現できないことから研究の遅延が懸念されたが、代替酵素としてYgjGを見出し、これをPMTと共発現させることで、N-mpyrの微生物生産を達成できた。さらに、培養液にGlucoseを添加することでその生産量が増加することも見出した。また、N-mpyrを消費し得る大腸菌内在性の酵素を見出し、その二重破壊株においてN-mpyrの消費を解除することを達成した。
これにより、2018年度以降の研究でNicotineやTropinoneの骨格形成反応を担う酵素の同定を達成した時に、即座にそれらの微生物生産を行える環境を整えることが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
Nicotineの骨格形成反応を担う酵素の同定については、Berberine bridge enzyme様酵素(BBLa)の合成遺伝子を大腸菌および発現が確認されているPichiaを用いてその組換え酵素の取得を行う。取得された組換えBBLaとA622を用いて、ニコチン酸またはその類縁体とN-mpyrを、酸化体または還元体の補酵素存在下で反応させ、反応物をLC-MSに供することで化合物の変換の有無の検討を行う予定である。
Tropinoneの骨格形成反応を担う酵素の同定については、予備実験においての分析条件が不適切だった可能性が考えられたため、再度Diketidyl-CoAまたは3-oxoglutaric acidがN-mpyrとmannich likeに縮合するかを分析系の再検討も含めて行う予定である。これにより、それらが縮合した時はDiketidyl-CoAまたは3-oxoglutaric acidを合成し得る酵素をヒヨスまたはナス科の植物の粗酵素またはcDNAから探索する予定である。
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