| 研究課題/領域番号 |
17K18226
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| 研究機関 | 鈴鹿医療科学大学 |
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研究代表者 |
及川 弘崇 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (00732041)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 酵素療法 / β-グルクロニダーゼ / GUS / GUS-D6 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、運動神経の主病変部位に蓄積するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)を標的とした薬剤による家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)性神経障害の治療方法の確立を目的としている。初年度ではマウス脊髄由来神経芽細胞腫であるNeuro-2aの培養系を用いて、CSPG条件下でのNeuro-2aの細胞体の減少を5,000 U/g のGUS投与によって抑制することを観察している。また、β-グルクロニダーゼ(GUS)投与群で神経細胞特異的マーカーであるMAP-2の陽性タンパク質の増加と軸索様形態が観察された。これにより、GUS-D6の神経細胞への有用性が推察された。よって次年度はALPモデルマウスに対する酵素投与療法の前臨床試験の条件決定を主として行う予定であった。ALPマウスに投与するのに先駆けて、自然型のマウスを用いて、GUSの酵素組織移行性について検討した。NativeGUSをマウス尾静脈注射を行い、投与20分後の大脳皮質と脊髄を摘出してGUS酵素活性を検討したところ、250 U/mLの投与に対して、大脳皮質では426.9 μU/mLであり、脊髄では515.13 μU/mLであった。大脳皮質の平常時でのGUS濃度は213.1 μU/mLであり、脊髄での平常時のGUS濃度が242.4 μU/mLであるため、250 U/mL濃度の静脈注射であっても、20分後には中枢神経系へ通常時の2倍の濃度になるGUSを送達することが可能であることが明らかとなった。GUSの半減期が約5分であり、GUS-D6の半減期が約30分であるのでそれを加味し、ALPモデルマウスへの投与計画を検討中である。また、一方で、GUS-D6は市販されている酵素ではなく、我々の研究グループのみ所持するものであり市販されていないので自主精製が必要である。使用量に応じた酵素精製が必要なため、酵素精製も進行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度と次年度の目的として(1)GUS-D6酵素精製サイクルを申請者の所属研究室で立ち上げ、本研究終了までに必要となる酵素を精製し蓄積する。(2)GUS-D6の神経細胞への有用性をin vitro解析により証明する。(3) 酵素療法条件設定のためにALSモデルマウス検体を投与計画別に準備する。(4)投与計画別の脊髄中GUS-D6活性を指標とし、酵素療法の至適条件を決定する。であった。このうち、native型のGUSの実験が先行している状況である。前年度から遅延の理由の最大原因として、本研究計画申請後にアメリカ合衆国大統領が変ったことにより、組み換え遺伝子を持つベクターといったような生物学的資源の移譲や分譲の規則が厳しく変更になったため、ベクター入手までに予想以上の時間がかかっているということがあったが、結果としてrecombinantのGUS-D6のベクターの入手が不可能となり、native型のベクターを入手したことによる。それにより、組み替え型の作成から進めているため、recombinant型のGUS-D6の計画が遅れているため、native型のGUSの研究が先行している状況である。そのため、進捗状況を「やや遅れている」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後とも、GUS-D6の酵素精製を最優先課題とする。また、GUS-D6の神経系への及ぼす影響について神経突起伸長マーカー(Gal-1,GAP43)や樹状突起マーカー(MAP-2)をウエスタンブロット法(WB)や免疫染色法(IHC)によって精査が必要である。よって、初年度に行ったNeuro-2aを用いた検討をGUS-D6の精製で十分な量が確保でき次第行う。CSPGによる神経突起伸長阻害モデルはおおよそ確立できているため、初年度研究計画と次年度研究計画を随時検討可能であり、本研究目的は十分に達成可能である。また、当初予定では1,000 U/g、2,500 U/g及び5,000 U/gのGUS-D6を用いた酵素投与療法の計画であったが、次年度の検討結果より、低用量のnativeGUS投与でも20分後には中枢神経系へ通常時よりも2倍の酵素活性を示せるほど酵素が送達されていることが明らかとなったので、低濃度の250 U/mLの条件での6日間の治療計画を予定している。静脈投与を①初日単回投与した群、②3日間隔で投与した群(2回投与群)、③2日間隔で投与した群(3回投与群)の3群に分けて行う。その後、屠殺解体し脊髄検体を採取し脊髄中のGUS酵素活性をGUSアッセイキットにより測定と、脊髄の神経の形態学的な変化とCSPGの免疫染色により、効果的な投与計画の設定を組み直す。その投与計画をもとにALPモデルマウスへの酵素投与実験を行い、酵素療法によるALS病態進行遅延効果を行動実験により証明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に入手予定であったGUS-D6オリジナルベクターが結果的に入手できなく、得られたものはnative型のGUSベクターであったため、酵素精製スケジュールの変更を余儀なくされた。当初は初年度に必要量の酵素精製がある程度進み、酵素確保をある程度する予定だったが現在は同時進行状態である。そのため、使用計画が後方にずれ込んでいる。濃縮装置やフラクションコレクターの準備はできたため、グラディエントポンプ(Bio-Rad: 731-9001JA)の購入と必要量の酵素を確保するための大量細胞培養メディウムの購入を予定している。
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