2021 年度実施状況報告書

GUS-D6を用いた新たなCSPG分解療法の確立とそのALSへの応用

研究課題

研究課題/領域番号	17K18226
研究機関	鈴鹿医療科学大学
研究代表者	及川弘崇鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (00732041)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2023-03-31
キーワード	β-グルクロニダーゼ / 酵素精製
研究実績の概要	本研究では中枢移行性が高い酸性アミノ酸鎖を付加したβグルクロニダーゼ(GUS)によるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解能力を利用し、ALS性神経障害の治療法の確立を目的としている。本研究では初年度にマウス脊髄由来神経芽細胞種であるNeuro-2a細胞株において、CSPG条件下での細胞体の減少を5,000U/gのNative型GUS投与によって抑制することを観察した。また、CSPG条件下のマウス大脳皮質由来初代培養神経細胞においてGUS投与を行うと神経細胞特異的マーカーであるMAP-2の増加と軸索様形態を観察した。しかしながら、3年目ではラット大脳皮質由来初代培養神経細胞では5000 U/gのGUS適用だと細胞死が惹起されたため、4年目でGUS濃度を500 U/gに減量することにより、有意ではないが細胞体の減少抑制することができた。これをふまえ、1000 U/g ,500 U/g,250 U/g濃度のGUSを前臨床試験使用に使用した。一方で、2年目にNative型GUSの組織移行性について検討した。250 U/mL(10000 U/g)のNative型GUSをマウス尾静脈投与し投与後20分後の大脳皮質と脊髄を摘出し、GUSの酵素活性を検討したところ、平常時よりも大脳皮質において2倍、脊髄で2.5倍の酵素活性を観察している。以上の実験はGUS酵素精製に難航していたため、MP Biomedicals,IncのGUS溶液を使用して行った。5年目に、これまで使用してきたGUS溶液を使用し、前臨床試験を行った。1000 U/g ,500 U/gそして250 U/gのGUSを野生型マウス尾静脈に投与したところ1週間以内に死亡したため、精製予定酵素のNative型の粉末を別途購入し病態モデルマウスを使用した前臨床試験を行うための投与濃度の検討を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由昨年度報告の際に酵素活性の高いクローンが死活したためのリクローニングを行ったが活性の高いクローンを得られていないのが潤沢な酵素確保が条件の本研究の遅延の第1要因である。酵素活性の高いGUS-D6とNative型GUSを遺伝子導入したCHO-K1細胞の生成を続けているのが現状である。しかしながら、本研究課題の目的を達するためには少なくともNative型のGUSだけでもALSモデルマウスへの影響を明らかにする必要があるため、Native型のGUS溶液を購入し実験に使用していたが、野生型マウスが1週間以内に死亡してしまった。以前報告した論文では研究代表者が精製した酵素を使用していたので、GUS溶液ではなく高価ではあるがGUS粉末を購入しGUS溶液調整を行っている。 ALSモデルますに関しては輸入元の動物管理条件と研究代表者が所属する機関の動物舎の管理条件のずれがあり、動物搬入の遅れが生じているため本研究遅延の第2要因である。詳細としては24時間365日体制での獣医師資格者、またはそれ相当の経験を有するものの監督下での動物管理条件を満たす旨の指示ではあったが、日本国内ではその条件はないため、その対応のすり合わせをしているのが現状である。 SARS-cov-2流行が未だ続いているのは周知の事実だと思われる。一昨年より対応した遠隔授業をベースとする予定ではあったが、SARS-cov-2の罹患者数の増減により対面授業も組み入れたため、ハイブリット形式への必要も出てきた。そのため既存科目と新科目で対応を余儀無くなったため、酵素精製過程に遅延が生じたのが第3要因である。以上の事由により、「遅れている」と判断した。
今後の研究の推進方策	今後とも、GUS-D6の酵素精製を最優先課題とする。また、GUSの中枢移行も短期間においては確認できてはいるが、まずは精製酵素と同型の新しいNative型GUSを用いた前臨床試験を行う。これまでのNative GUSとGUS-D6の神経系への及ぼす影響についてのin vitro実験の結果はあったが、in vivo適用でマウスを短期間で絶命してしまうため、新しいNative型GUSとGUS-D6を用いて再現をとり、論文にまとめたい。 ALSモデルマウスに関しては輸入元からの搬入があり次第、随時ジェノタイピングによりモデルマウスを絞り込み、早期より酵素治療を行い生後4ヶ月時点での症状の発症比較を行い、酵素の影響を精査する。必要量のGUS-D6の確保が急務であるが、同時にGUSの確保も継続し、モデルマウスの確保が出来次第、前臨床試験を行い当初予定の結果を本年度中にまとめる。具体的には年単位での長期投与の解析は現段階においては困難なため、ALSモデルマウスに対し出生後3ヶ月まで酵素を投与し病理的な解析をすることを第一とする。その際、投与酵素に関してはこれまでの結果より1000 U/g ,500 U/gそして250 U/gの濃度で検討を行う。この濃度設定であると当初より使用する酵素濃度が少ないため、酵素精製の遅延をカバーでき、本研究目的達成のためのリカバリーが行える。少なくともNative型GUSの効能効果を明らかとし、それを論文にまとめ、学会発表を行う。また、GUS-D6に関してもNative型GUSの効能効果と比較し、その有効性を明らかとし、論文にまとめ、学会発表を行う。
次年度使用額が生じた理由	実験動物輸入元と研究代表者が所属する動物施設の管理条件の違いがあったために動物輸入に遅延が起きており、その動物代金と輸入代金の使用が行われていないために次年度使用額が生じている。上述の問題が解決次第、動物購入と輸入代金として使用される。