心肥大の分子メカニズム解明を目指した比較グライコプロテオミクス

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K18414
• 研究機関: 国立研究開発法人産業技術総合研究所
• 研究代表者: 岡谷 千晶 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (30633648)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 心肥大モデル / 比較グライコーム解析

研究実績の概要

心肥大・心不全に至る分子メカニズムの解明は、心不全治療法の開発における重要課題である。糖鎖修飾は、タンパク質の細胞内局在やプロセシングの制御などを介して、タンパク質機能を制御することが知られている。本研究は、肥大状態の心筋細胞において生じる糖鎖修飾の異常と心肥大シグナルとの関連性を探ることにより、心肥大シグナルにおけるタンパク質上糖鎖修飾の意義を分子レベルで明らかにすることを目的とした。
平成29年度は、まずin vitro心肥大モデルの作出条件を検討した。ラット心室由来心筋細胞を対象とし、肥大刺激としてangiotensin II、endothlin-1、phenylephrine、isoproterenolを曝露する際の条件を検討した。細胞面積およびアクチンフィラメント染色により肥大の程度を評価することにより、最適な培養条件（培地組成、コーティング剤および播種密度）、薬剤濃度および薬剤曝露時間を決定した。この検討の際に、レクチンアレイ（45種類のレクチンを搭載）を用いた比較グライコーム解析により、コーティング剤の有無や培地中の血清の有無によって全細胞抽出液の糖鎖プロファイルが変化することを見出した。
次に、決定した条件により薬剤を曝露した細胞（心肥大群）および薬剤を曝露していない細胞（対照群）から、培養上清、全細胞溶解液、細胞親水性画分・疎水性画分を調製し、レクチンアレイによる比較グライコーム解析を実施した。その結果、対照群と比較して心肥大群では、細胞疎水性画分の糖鎖プロファイルが変化することを見出し、その変化を検出するために有効なレクチンプローブを選出できた。
また、O型糖鎖のグライコプロテオーム解析に向けて、O型糖鎖生合成に関与する糖転移酵素をノックアウトしたラット心筋細胞の作出を進め、目的遺伝子をノックアウトした細胞プールの取得に成功した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

不死化ヒト心筋細胞に関しては、供給先の都合により細胞の入手が予定より遅れ、また、細胞の培養条件および保存条件の最適化に予想以上に時間を要したため、計画していた実験を年度内に十分に行えなかった。一方、ラット心室由来心筋細胞に関しては、１）分析試料調製法の決定、２）肥大刺激による糖鎖プロファイルの変化の解析、３）糖転移酵素ノックアウト細胞の作出、を計画通り順調に推進でき、肥大刺激による糖鎖プロファイル変化の検出に成功している。

今後の研究の推進方策

まず、平成29年度に着手が遅れた不死化ヒト心筋細胞について、ラット心室由来心筋細胞を用いて確立した心肥大モデル作出条件・試料調製法・解析法を適用し、比較グライコーム解析およびグライコプロテオーム解析を推進する。N型糖鎖のグライコプロテオーム解析については、ラット心筋細胞の比較グライコーム解析では細胞疎水性画分にてN型糖鎖上の糖鎖変化が見られたことから、糖鎖変化を検出しうるレクチンプローブを用いて捕集した画分の解析に注力する。O型糖鎖のグライコプロテオーム解析については、既に糖転移酵素ノックアウト細胞が得られているラット心筋細胞について優先的に推進し、クローン化した細胞の表現型解析を行い、野生型と同様の刺激にて肥大がみられるかどうかを確認した後、グライコプロテオーム解析を実施する。

次年度使用額が生じた理由

研究実施に必要となる不死化ヒト心筋細胞の入手・実験のセットアップが遅れたために、遂行できなかった実験計画分の研究費を次年度に持ち越すこととした。これらの研究費は、次年度に実施する実験に使用する消耗品（試薬類、プラスチック器具等）に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Ratio of pro-B-type natriuretic peptide (BNP) to total BNP is decreased in mild, but not severe, acute decompensated heart failure patients: A novel compensatory mechanism for acute heart failure (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahama Hiroyuki、Takashio Seiji、Nishikimi Toshio、Hayashi Tomohiro、Nagai-Okatani Chiaki、Nakagawa Yasuaki、Amaki Makoto、Ohara Takahiro、Hasegawa Takuya、Sugano Yasuo、Kanzaki Hideaki、Yasuda Satoshi、Kangawa Kenji、Minamino Naoto、Anzai Toshihisa
  • 雑誌名: International Journal of Cardiology 巻: 258 ページ: 165～171
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2017.12.047
  • 査読あり
• [雑誌論文] Three molecular forms of atrial natriuretic peptides: quantitative analysis and biological characterization (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagai-Okatani Chiaki、Kangawa Kenji、Minamino Naoto
  • 雑誌名: Journal of Peptide Science 巻: 23 ページ: 486～495
  • DOI: 10.1002/psc.2969
  • 査読あり
• [雑誌論文] Circulating osteocrin stimulates bone growth by limiting C-type natriuretic peptide clearance (2017)
  • 著者名/発表者名: Kanai Yugo、Yasoda Akihiro、Mori Keita P.、Watanabe-Takano Haruko、Nagai-Okatani Chiaki、Yamashita Yui、Hirota Keisho、Ueda Yohei、Yamauchi Ichiro、Kondo Eri、Yamanaka Shigeki、Sakane Yoriko、Nakao Kazumasa、Fujii Toshihito、Yokoi Hideki、Minamino Naoto、Mukoyama Masashi、Mochizuki Naoki、Inagaki Nobuya
  • 雑誌名: Journal of Clinical Investigation 巻: 127 ページ: 4136～4147
  • DOI: 10.1172/JCI94912
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of continuous reduction in B-Type natriuretic peptide bioactivity during hospitalization in patients with advanced heart failure (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Takahama, Seiji Takashio, Tomohiro Hayashi, Chiaki Nagai-Okatani, Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Makoto Amaki, Takahiro Ohara, Takuya Hasegawa, Yasuo Sugano, Hideaki Kanzaki, Satoshi Yasuda, Kenji Kangawa, Naoto Minamino, Toshihisa Anzai
  • 雑誌名: Circulation 巻: 136 ページ: A16248～A16248
  • オープンアクセス
• [学会発表] Association of ratio of proBNP to total BNP with heart failure severity: A novel compensatory mechanism for acute heart failure (2018)
  • 著者名/発表者名: 高濱博幸、高潮征爾、錦見俊雄、林友鴻、岡谷千晶、中川靖章、天木誠、大原貴裕、長谷川拓也、菅野康夫、神﨑秀明、安田聡、寒川賢治、南野直人、安斉俊久
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] ProBNP ratio to total BNP predicts future cardiac reverse remodeling in acute heart failure patients with reduced ejection fraction (2018)
  • 著者名/発表者名: 高濱博幸、高潮征爾、錦見俊雄、林友鴻、岡谷千晶、中川靖章、濱谷康弘、岡田厚、天木誠、長谷川拓也、菅野康夫、神﨑秀明、安田聡、寒川賢治、南野直人、安斉俊久
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] レーザーマイクロダイセクション－レクチンマイクロアレイによるマウス組織グライコームマッピング (2017)
  • 著者名/発表者名: 岡谷千晶、角田修一、Xia Zou、吉田真樹、佐藤隆、松田厚志、萩原梢、清原克恵、板倉、陽子、野呂絵里花、豊田雅士、Yan Zhang、成松久、久野敦
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2017年大会
• [学会発表] A comprehensive analysis of glycome profiles on formalin-fixed paraffin-embedded mouse tissue sections (2017)
  • 著者名/発表者名: Chiaki Nagai-Okatani, Shuichi Kakuda, Xia Zou, Maki Yoshida, Takashi Sato, Atsushi Matsuda, Kozue Hagiwara, Katsue Kiyohara, Yoko Itakura, Erika Noro, Masashi Toyoda, Sheng-Ce Tao, Yan Zhang, Hisashi Narimatsu, Atsushi Kuno
  • 学会等名: 16th Human Proteome Organization World Conress
  • 国際学会
• [学会発表] Development of site-specific glycome analysis method of complex glycoproteome (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Kaji, Azusa Tomioka, Chiaki Nagai-Okatani, Erika Noro, Toshihide Shikanai, Hisashi Narimatsu.
  • 学会等名: 16th Human Proteome Organization World Conress
  • 国際学会
• [学会発表] 複雑性の極み: 糖鎖修飾状態の解析への挑戦 (2017)
  • 著者名/発表者名: 梶裕之、富岡あづさ、野呂絵里花、岡谷千晶、藤田弥佳、助川昌子、成松久
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] C型ナトリウム利尿ペプチドに対する高感度特異的測定法の開発と血中および組織中の濃度測定 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松尾文香、岡谷千晶、寒川賢治、南野直人
  • 学会等名: 第90回日本内分泌学会学術総会
• [学会発表] Impact of continuous reduction in B-Type natriuretic peptide bioactivity during hospitalization in patients with advanced heart failure (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Takahama, Seiji Takashio, Tomohiro Hayashi, Chiaki Nagai-Okatani, Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Makoto Amaki, Takahiro Ohara, Takuya Hasegawa, Yasuo Sugano, Hideaki Kanzaki, Satoshi Yasuda, Kenji Kangawa, Naoto Minamino, Toshihisa Anzai
  • 学会等名: American Heart Association Scientific Sessions 2017
  • 国際学会
• [図書] 病理と臨床 特集「パラフィン包埋標本でできる分子病理解析 Up To Date」パラフィン包埋標本を用いた比較組織グライコーム解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松田厚志、岡谷千晶、久野敦
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 文光堂