| 研究課題/領域番号 |
17K18895
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
北島 正章 北海道大学, 工学研究院, 助教 (30777967)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | バクテリオファージ / Shigella / 単離 / 全ゲノム解析 / Klebsiella |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、水系感染性細菌の中でも特に世界中で甚大な健康被害を出している赤痢菌(Shigella)に着目し、赤痢菌に感染する溶菌性バクテリオファージ(以下ファージ)の探索と特性解析を行った。昨年度下水中から単離した4株のファージ単離株のうち、最も宿主範囲の広かったSfPhi01について、全ゲノム情報解読に基づく特性解析を実施した。SfPhi01株を宿主菌と共培養することによりファージ培養液を作製し、更にファージ画分を濃縮することで高濃度ファージ液を得た。この高濃度ファージ液からファージDNAを抽出・精製し、次世代シークエンシングによる全ゲノム解析に供した。ゲノム解析の結果、このファージは全長168kbの環状二本鎖DNAをゲノムとして有することが分かった。データベース上のファージ遺伝子情報と照合した結果、このファージはMyoviridae科に属する新規ファージであることが明らかとなった。赤痢菌に感染するファージに関する新たな知見を得ることができたと言える。
また、環境中に広く存在する病原細菌として知られているKlebsiella属細菌の溶菌性ファージの探索も行った。具体的には、流入下水試料からKlebsiella属細菌を宿主菌としてファージを集積した後、スポットテストによりファージの存在を確認した。ファージが確認された試料についてプラーク単離を3回繰り返すことでファージを単離した。単離ファージ株を透過型電子顕微鏡(TEM)により観察したところ、形態学的特徴からMyoviridae科とSiphoviridae科に属すると判断された。宿主菌のKlebsiella属細菌(S05株)ならびに単離ファージ(05F01株)の双方について次世代シークエンシング技術を用いた全ゲノム解析を実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度（二年目）の到達目標は、環境試料から水中病原細菌に感染するファージを単離し、その特性を解析することであった。赤痢菌に感染するファージの全ゲノム配列を次世代シークエンシングにより解読し、ゲノム構造や遺伝系統学的分類を明らかにした。
更に、赤痢菌ファージだけではなくKlebsiella属細菌に感染するファージの単離にも成功しており、こちらも全ゲノム配列解読に基づく特性解析を実施した。ファージ遺伝子とタンパク質の解析から、デポリメラーゼ(バイオフィルムを構成するEPSの分解に寄与する酵素)をコードする遺伝子の候補を見出すことに成功したことは特筆すべき成果である。
全体としては、当初の計画に基づきおおむね順調に研究が進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究で同定したKlabsiellaファージのデポリメラーゼ候補遺伝子を大腸菌で発現させ、このタンパクがデポリメラーゼ酵素活性（バイオフィルム破壊能）を示すかどうかを調べることで、デポリメラーゼの特定を試みる。デポリメラーゼの特定に成功すれば、この酵素によるEPS成分の分解特性を詳細に解析する。
続いて、実験室内で環境中での存在状況を模擬した条件(すなわち水中浮遊状態およびバイオフィルム)の宿主病原細菌を準備し、単離したファージがそれぞれ の状態の細菌に対して示す溶菌能を明らかにする。低温(4度)から高温(44度)(それぞれ冬季と夏季の水道配水管内の環境を模擬)までの温度域における感染・ 溶菌能を評価し、ファージ活性の温度依存性を明らかにする。単離株ライブラリ中のファージの溶菌能を比較し、水道水中の病原性細菌制御という目的での実用性を有するバクテリオファージを見出す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究が順調に進捗し、計画よりも少ないサンプル解析数および期間でファージ単離株が得られた。また、次世代シークエンシング技術を用いたファージの全ゲノム解析にあたっては、米国ミネソタ大学との国際共同研究によりミネソタ大の共用設備を使用することができたため、計画よりも安価に解析を実施することができた。そのため、全体的に当初の見積もりよりも少ない費用(物品費・ 解析費)でファージ単離株の特性解析ができた。
次年度には、さらにファージ単離ライブラリを充実させるため次年度使用額相当分を消耗品費として使用してファージの探索を進めるとともに、次世代シークエンシングによるファージの塩基配列解読に使用する予定である。
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