|
本研究では，インクジェット技術による微小液滴を利用し超瞬間的に凍結することで，凍結保護剤フリーの凍結保存手法を確立することを目指している．H30年度までは，凍結工程に着目し研究を進めてきたが，さらなる凍結手法の改善には，解凍工程も含めた全行程の改善が必要であることが明らかになってきた．そこで，本年度は，凍結後の運搬，保管，さらにその解凍工程についても検討することで，凍結保護剤フリーの超瞬間凍結保存法を確立した．
まず，超瞬間凍結後の細胞内包液滴運搬時の昇温を抑制することで，昇温による脱ガラス化を防ぎ，融解後の生存率向上に取り組んだ．基板を運搬する操作を想定し，液体窒素で冷却されたベース上面から15 mm持ち上げた際の昇温について測定した．その結果，基板上のガラス化された液滴は，何も対策をしなければ1秒以内にガラス転移点以上に温められ脱ガラス化してしまうのに対し，アルミ製のカバーなどで対策した場合は，6秒後もガラス転移点以下に保たれており，ガラス化状態を維持できるだろうことが分かった．
次に，手動で行っていた解凍操作を自動化することで，解凍速度の上昇による生存率向上と操作によるばらつきの抑制を試みた．解凍の際は，凍結液滴のある基板上面から，温めた培養液に投入されることが望ましい．そこで，ばねヒンジを用いて，凍結基板を180度回転させつつ，マクロチューブ内へ投げ入れる装置を，3Dプリンタとアルミの機械加工により製作した．高速度カメラの観察によると，この装置の動作時間は，20ミリ秒程度であり，手動操作の5秒程度に比べると大幅に短縮された．また，この装置により，同条件で瞬間凍結された細胞の生存率が10％程度向上し，凍結保護剤を用いた従来法と同等の生存率が得られるようになった．
|
