| 研究課題/領域番号 |
17K19133
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
西澤 精一 東北大学, 理学研究科, 教授 (40281969)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| キーワード | ノンコーディングRNA / 蛍光インジケーター / 検出 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、阻害剤開発を強力に支援しうるFID（Fluorescence indicator displacement assay）法の次世代蛍光インジケーターとして、rRNAのA-site に対して特異的に結合し、かつ赤色蛍光を示すRNA結合リガンドを開発することを試みる。さらに、現在、阻害剤開発の重要なターゲットとなっている、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のTAR RNA（Trans-activation responsive region RNA）及びHCV (C型肝炎ウイルス) RNAのIRES（Internal ribosome entry site）等を研究対象として、これらのノンコーディングRNAに特異的に結合する赤色蛍光インジケーターの開発も試み、方法論（RNA結合リガンドの開発概念・活用法）としての汎用性と有用性を実証することを目指す。
平成29年度は、赤色蛍光を示すシアニン色素誘導体に着目し、A-site（バルジ部位）に対する結合能と蛍光応答を評価することで、A-site結合に適した基本骨格のスクリーニングを進めた。その結果、2種のヘテロ環がトリメチンリンカーで連結された構造をもつシアニン色素がA-siteに極めて強く結合すること（解離定 410 nM）、また、light-up型の明瞭な赤色蛍光応答（極大波長 669 nm）を示すことを見出した。この赤色蛍光色素の結合特性は優れたもので、A-siteに対して高選択的に結合し、その結合力は既存の非アミノグリコシド系のA-site結合分子の中でも最高レベルである。こうした知見は今までに報告がなく、A-siteを標的とする赤色蛍光色素の開発を進める上で、極めて重要な知見になると期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「研究実績の概要」で述べたように、現段階において、rRNAのA-site に対して高選択的に結合しうる赤色蛍光色素を見出すことに成功している。また、三重鎖形成ペプチド核酸（PNA）プローブについても開発を進めており、これまでに蛍光色素を疑似塩基として組み込んだPNAプローブを用いることで、従来困難とされてきたRNA二重鎖構造（塩基配列）の迅速かつ高選択的な検出が可能であることを見出している（JACS 2016; Chem. Eur. J. 2017; Org. Biomol. Chem. 2017; Org. Biomol. Chem. 2018）。DNA を骨格とする従来の三重鎖形成核酸プローブと比較して、PNAプローブの優れた特性は、（i）RNA二重鎖結合タンパク質（受容体）に匹敵する結合力を発現すること、また、（ii）極めて迅速（～180秒）かつ塩基配列選択的に三重鎖形成が進行することで、今後、バルジ部位選択的な赤色蛍光色素と連結することにより、rRNAのA-site に対して特異的な結合機能と検出機能を兼ね備えた赤色蛍光インジケーターが実現すると期待できる。
以上のように、本研究は、おおむね順調に進展していると自己評価している。
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| 今後の研究の推進方策 |
概ね当初の研究計画に従って研究を進める。すなわち、rRNAのA-siteやTAR RNA、IRESは、いずれもバルジ部位を有した二重鎖構造をとっていることに着目し、(1)バルジ部位にある程度選択的に結合できる赤色蛍光色素を開発、さらに(2) バルジ部位に隣接する二重鎖部分に、三重鎖形成を介して塩基配列選択的に結合するペプチド核酸（PNA）を赤色色素に連結することで、バルジ部位に対する特異的な結合選択性を有する赤色蛍光RNA結合リガンドを開発する。これと並行して、構造最適化を進めたRNA結合リガンドをFID法に適用し、蛍光インジケーターとしての機能を評価する。さらに、スクリーニングにより見出した候補化合物に対して、A-site との相互作用ならびにin vitro rRNA 機能阻害能を評価する（TAR RNA及びIRES等に関しても同様）。
以上のように研究を遂行し、本研究で開発する蛍光インジケーターを用いたFID法の有用性を実証することを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題を遂行する上で必須な実験装置である超純水製造装置が故障した（平成29年12月）。現在、応急措置により稼働しているものの、新規購入が必要となった。本研究課題の年度予算（250万円）と購入金額（181万円）を考慮した結果、次年度購入が最善であると判断した。
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