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2018 年度 実施状況報告書

卵黄タンパク質置換型高効率タンパク質発現システムの開発

研究課題

研究課題/領域番号 17K19236
研究機関大阪大学

研究代表者

渡辺 肇  大阪大学, 工学研究科, 教授 (80212322)

研究期間 (年度) 2017-06-30 – 2020-03-31
キーワードミジンコ / ビテロジェニン / GFPタンパク質
研究実績の概要

本研究では、遺伝子工学的手法を用いて卵黄タンパク質を有用タンパク質と入れ替え、卵内に有用タンパク質を蓄積させるシステムの開発を目的とする。
対象生物としては飼育と繁殖が迅速かつ簡便に行えるミジンコを用いる。ミジンコは微小なものの高密度で飼育できることから、卵黄タンパク質を有用タンパク質と置き換えることができれば容易に大量の目的タンパク質を得られる。エサは炭酸固定としても注目されている緑藻を用いることから、「炭酸固定をしながら水から有用タンパク質を作る」ことが可能になる。
(1) このために細胞外へタンパク質を分泌するのに必要な分泌シグナルペプチドと GFP を融合させた「分泌型 GFP 融合遺伝子」を挿入したプラスミドを作製した。
(2) この作製したプラスミド DNA を一過的に卵に導入し、融合遺伝子産物の局在を蛍光顕微鏡で観察し、細胞外にGFPタンパク質が分泌されていることを確認した。並行してマイクロキャピラリーを用いてヘモリンフを採取し、蛍光の測定およびウエスタン法などで、実際にヘモリンフ中に分泌される融合タンパク質を確認した。
(3)この「分泌型 GFP 融合遺伝子」にさらにビテロジェニン受容体と相互作用するドメインを融合させ、 「ビテロジェニン受容体結合 GFP 遺伝子」を作製した。
(4) 作製した「ビテロジェニン受容体結合 GFP 融合遺伝子」をミジンコ卵に顕微注入するこことよより、その融合遺伝子を発現させることに成功した。一過的な解析においては、融合遺伝子を注入後、約1週間培養をつづけ、育房に産み付けられた卵を回収したところ、蛍光顕微鏡観察によってマーカーとしている GFP タンパク質の卵への蓄積を確認することができた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

震災の影響で水槽が被害を受けたほか、その後のミジンコの生育も正常になるのに時間を要したことから、予定よりもやや遅れている。しかしその後、順調に回復していることから、予定通りに本研究課題を遂行できると思われる。

今後の研究の推進方策

「ビテロジェニン受容体結合型GFP遺伝子」をCRISPR/Cas9 を用いてビテロジェニン遺伝子の下流に挿入する。
また実際にビテロジェニン遺伝子を組換えタンパク質産生遺伝子と置換するための遺伝子操作を行う。
具体的には下記の操作を予定している。
(1)「ビテロジェニン受容体結合型 GFP 遺伝子」をもつトランスジェニック系統を用い、ビテロジェニン遺伝子の両端にloxP配列を挿入する。挿入に際してはCRSPR/Cas9 を用いる。 (2) (1)の loxP の系統と並行して Cre リコンビナーゼ発現系を作製する。ヒートショック遺伝子の制御領域下に Cre リコンビナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックミジンコを作製する。(3) (1)の loxP 系統および(2)の Cre 系統を掛け合わせ Cre-loxP が機能する系統を作製する。ミジンコは通常単為生殖で増殖するためメスしか存在しないが、ミジンコを幼若ホルモン処理することでオスを作ることができ交配が可能に
なる。この系統を用いて実際にヒートショック処理をすることにより、「ビテロジェニン受容体結合型 GFP 遺伝子」が卵黄遺伝子のかわりに卵内に蓄積されることを確認する。(4) 実際に作製した HSP70A(プロモーター)-Cre 遺伝子 と「ビテロジェニン受容体結合型 GFP遺伝子」をもつ系統を用いて、ヒートショックにより卵内に GFP 遺伝子産物が蓄積されることを確認する。

次年度使用額が生じた理由

震災の影響により、水槽が被害を受けたため。
研究材料であるミジンコの飼育が適切に行えなくなり、また研究の使用に可能耐えうるような順調に飼育されたミジンコの調整がが可能となるまでに時間を要した。

  • 研究成果

    (28件)

すべて 2019 2018 その他

すべて 雑誌論文 (8件) (うち国際共著 2件、 査読あり 8件、 オープンアクセス 6件) 学会発表 (19件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Atrazine exposed phytoplankton causes the production of non-viable offspring on Daphnia magna2019

    • 著者名/発表者名
      Religia Pijar、Kato Yasuhiko、Fukushima Ery Odette、Matsuura Tomoaki、Muranaka Toshiya、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      Marine Environmental Research

      巻: 145 ページ: 177-183

    • DOI

      10.1016/j.marenvres.2019.02.007

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Tryptophan hydroxylase (TRH) loss of function mutations induce growth and behavioral defects in Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Rivetti Claudia、Campos Bruno、Pina Benjamin、Raldua Demetrio、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime、Barata Carlos
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 1518

    • DOI

      10.1038/s41598-018-19778-0

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Microbiota inoculum composition affects holobiont assembly and host growth in Daphnia2018

    • 著者名/発表者名
      Callens Martijn、Watanabe Hajime、Kato Yasuhiko、Miura Jun、Decaestecker Ellen
    • 雑誌名

      Microbiome

      巻: 6 ページ: 56

    • DOI

      10.1186/s40168-018-0444-1

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Genomic integration and ligand-dependent activation of the human estrogen receptor α in the crustacean Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Toerner Kerstin、Nakanishi Tsuyoshi、Matsuura Tomoaki、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 13 ページ: e0198023

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0198023

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Generation of white-eyed Daphnia magna mutants lacking scarlet function2018

    • 著者名/発表者名
      Ismail Nur Izzatur Binti、Kato Yasuhiko、Matsuura Tomoaki、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 13 ページ: e0205609

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0205609

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] A 5′ UTR-Overlapping LncRNA Activates the Male-Determining Gene doublesex1 in the Crustacean Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Kato Yasuhiko、Perez Christelle Alexa G.、Mohamad Ishak Nur Syafiqah、Nong Quang D.、Sudo Yuumi、Matsuura Tomoaki、Wada Tadashi、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      Current Biology

      巻: 28 ページ: 1811~1817.e4

    • DOI

      10.1016/j.cub.2018.04.029

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Monitoring ecdysteroid activities using genetically encoded reporter gene in Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Adhitama Nikko、Matsuura Tomoaki、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      Marine Environmental Research

      巻: 140 ページ: 375~381

    • DOI

      10.1016/j.marenvres.2018.07.003

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A murine model of atopic dermatitis can be generated by painting the dorsal skin with hapten twice 14 days apart2018

    • 著者名/発表者名
      Kitamura Ayaka、Takata Ryohei、Aizawa Shin、Watanabe Hajime、Wada Tadashi
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 5988

    • DOI

      10.1038/s41598-018-24363-6

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 生殖戦略を決定する化学コミュニケーションの解明2018

    • 著者名/発表者名
      渡邉肇
    • 学会等名
      新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」第3回公開シンポジウム
  • [学会発表] A 5´UTR-overlapping LncRNA Activates the Male-determining Gene doublesex1 in the Crustacean Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato, Christelle Alexa G. Pelez, Nur Syafiqah Mohamad Ishak, Quang D. Nong, Tomoaki Matsuura, Tadashi Wada, Hajime Watanabe
    • 学会等名
      第 20 回 日本 RNA 学会年会
  • [学会発表] オオミジンコにおける毒性影響可視化のための遺伝子工学的手法の開発2018

    • 著者名/発表者名
      渡邉肇
    • 学会等名
      第45回日本毒性学会学術年会
  • [学会発表] Monitoring of chemical and metal contaminants using engineered Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato, Hajime Watanabe
    • 学会等名
      Second Interdisciplinary and Research Alumni Symposium iJaDe2018
    • 国際学会
  • [学会発表] オオミジンコにおける内分泌かく乱物質検出のためのGAL4/UASシステムの確立2018

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、山崎勇人、松浦友亮、渡邉肇
    • 学会等名
      第70回日本生物工学会大会
  • [学会発表] Visualization of ecdysteroid activities using genetically encoded reporter gene in Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Nikko Adhitama, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe
    • 学会等名
      第70回日本生物工学会大会
  • [学会発表] 気液界面培養下の気道上皮細胞への排ガス曝露影響評価法の検討-(1)送気流量の検討-2018

    • 著者名/発表者名
      伊藤剛、村木直美、田村久美子、利根川義男、石井幸雄、酒井康行、渡邉肇、高野裕久
    • 学会等名
      第59回大気環境学会年会
  • [学会発表] 気液界面培養下の気道上皮細胞への排ガス曝露影響評価法の検討-(2)線維芽細胞共培養の有効性の検討-2018

    • 著者名/発表者名
      村木直美、伊藤剛、田村久美子、利根川義男、石井幸雄、酒井康行、渡邉肇、高野裕久
    • 学会等名
      第59回大気環境学会年会
  • [学会発表] 再構成型無細胞翻訳系を用いたGタンパク質共役型受容体の安定化変異体の取得2018

    • 著者名/発表者名
      仲井宏紀、一色衣香、渡邉肇、村田武士、松浦友亮
    • 学会等名
      「細胞を創る」研究会11.0
  • [学会発表] In vitro evolution of E. coli multidrug efflux transporter EmrE by using liposome display2018

    • 著者名/発表者名
      内田紗衣、植田淳子、渡邊肇、松浦友亮
    • 学会等名
      「細胞を創る」研究会11.0
  • [学会発表] オオミジンコの遺伝子操作法の開発と応用2018

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、志賀靖弘、時下進一、山形秀夫、渡邉肇
    • 学会等名
      東京薬科大学生命科学部25周年記念シンポジウム
  • [学会発表] 環境応答により雌雄を産み分けるミジンコの性スペクトラム2018

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato、Christelle Alexa G. Perez、Quang D. Nong、Hajime Watanabe
    • 学会等名
      新学術領域研究 性スペクトラム 第二回 領域班会議
  • [学会発表] 多剤排出トランスポーターEmrEを検出素子とした細胞毒性化合物検出技術の開発2018

    • 著者名/発表者名
      服部将人, 渡邉肇, 松浦友亮
    • 学会等名
      第13回無細胞生命科学研究会
  • [学会発表] A 5' UTR-Overlapping LncRNA Activates the Male- Determining Gene doublesex1 in the Crustacean Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato、Christelle Alexa G. Perez、Quang D. Nong、Hajime Watanabe
    • 学会等名
      JAJ RNA 2018
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] オオミジンコにおけるHSP70プロモーターを利用した熱誘導型遺伝子発現系の開発2018

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、清水里奈、渡邉肇
    • 学会等名
      第41回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] 環境応答により雌雄を産み分けるミジンコの性スペクトラム2018

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、Quang Dang Nong、渡邉肇
    • 学会等名
      「先進ゲノム支援」2018年度拡大班会議
  • [学会発表] Alterations in the activity of the sex determination factor dsx1 resulted in different intersex phenotypes in Daphnia magna2018

    • 著者名/発表者名
      Quang Dang Nong , Yasuhiko Kato , Hajime Watanabe
    • 学会等名
      「先進ゲノム支援」2018年度拡大班会議
  • [学会発表] Possibility of chemical communication among Daphnia individuals for reproductive strategy2018

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato, Hajime Watanabe
    • 学会等名
      Frontier Research on Chemical Communications (ISCC2019)
    • 国際学会
  • [学会発表] 生態学と分子生物学の接点としてのミジンコ2018

    • 著者名/発表者名
      渡邉肇
    • 学会等名
      日本生態学会 第66回大会
    • 招待講演
  • [備考] 大阪大学工学研究科生命先端工学専攻渡邉研究室

    • URL

      http://www.bio.eng.osaka-u.ac.jp/ez/

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公開日: 2019-12-27  

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