| 研究実績の概要 |
当初計画では，ジベレリン生合成に関与するent-coparyl diphosphate synthase 1（CPS1）とGA20 oxidase (sd1)をターゲットとした変異導入をCas9遺伝子及び gRNA遺伝子を金粒子にコートし，iPB法によりコムギ茎頂に導入する予定であった．しかし，他のプロジェクトにおける研究進展から，金粒子を用いてRNPを直接茎頂組織に導入する手法が確立されたので，今年度は，次年度以降に検討する予定であった，RNP直接導入による変異創出を前倒しで行った．まず，コムギsd1遺伝子配列からターゲット配列をCRISPRdirectソフトウエアを利用してデザインした．gRNAはin vitro転写により合成し，大腸菌から精製されたCas9タンパク質と共に，金粒子に吸着させ，パーティクルガンにより茎頂組織に導入した．金粒子導入胚より植物体を成長させ，T0個体の止葉においてゲノムDNAを抽出し，CAPS解析を行った．これまでにボンバードメントを行った143胚あたり，8個体（6%）において変異が検出された．塩基配列解析から，これらのうち１個体においては，A,B,Dゲノム全てのsd1遺伝子において，変異が導入されていることが明らかとなった．CPS1遺伝子についてもsd1遺伝子同様の手法で変異導入を試みたが，A,B,D全てのゲノムに変異が検出されるような個体は得られなかった．
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