| 研究課題/領域番号 |
17K19253
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
志村 華子 北海道大学, 農学研究院, 講師 (20507230)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | ラン科植物 / マイコウイルス / 共生発芽 |
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| 研究実績の概要 |
レブンアツモリソウから分離された複数の菌株を用いてdsRNAを抽出してウイルス解析を行ったが、レブンアツモリソウに共生発芽能を示す菌株系統でのみ検出されるpartitivirusもあれば、複数の分離菌株において効率に検出されるpartitivirusもあることが分かった。また、レブンアツモリソウ以外のランから単離された菌株からはこれらのpartitivirusは検出されなかった。Partitivirusの感染とレブンアツモリソウへの共生発芽能との関わりを調べるために、継代培養によって共生発芽能が異なる菌株を作出したところ、分離以来ずっとin vitro発芽試験において高い共生発芽能を示した菌株において共生発芽率の低下が観察されるものが得られた。また、分離当初は共生発芽能が低かったが継代培養後に高い共生発芽能を示すようになった菌株も得られた。共生発芽能が変動した菌株について菌糸の増殖培養を行い、核酸を抽出してdsRNAを精製した。RT-PCRによりpartitivirus数種の有無を調べたところ、共生発芽能が低下した菌株ではpartitivirusが検出されなくなった。一方、共生発芽能が向上した菌株では新たに異なるpartitivirusが検出された。また、dsRNAの電気泳動ではpartitivirusと異なるサイズのバンドが確認され、部分配列のクローニングよりendornavirusやmegabirnavirusの配列が確認された。RNAサイレンシングの標的となりやすいdsRNAゲノムをもつマイコウイルスは宿主のRNAサイレンシングをどのように回避しているか分かっていない。レブンアツモリソウ共生菌のpartitivirusの数種においてCPのRNAサイレンシング抑制活性を評価したところ、活性があるものと全く活性をもたないものがあることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでレブンアツモリソウ共生菌からはpartitivirusの感染のみが確認されていたが、さらに他のマイコウイルスの感染を確認することができた。特に、レブンアツモリソウに共生発芽能を示す菌株で感染が確認されたのは、megabirnavirusやendornavirusであった。Megabirnavirusはまだ感染例が少ないマイコウイルスであり、菌根菌での感染確認は初めての例である。また、megabirnavirusはpartitivirusとの共存によって宿主菌への影響を及ぼす例が報告されていることから、レブンアツモリソウ共生菌においてもそのような影響がある可能性を示唆することができた。さらに、植物では複製量が少ないとされるpartitivirusのような微量なウイルス配列を検出する方法を見出し、複数の無菌培養サンプルにおいてpartitivirus配列を確認することができるようになった。さらに、partitivirusがコードするタンパク質のRNAサイレンシングサプレッサー活性を評価したところ、同じpartitivirusの遺伝子でもサプレッサー活性が異なっており、そのようなサプレッサー活性の異なるpartitivirusがともに宿主菌に感染していることが分かった。これらの成果をふまえ、研究計画はおおむね順調に進行していると考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
共生発芽試験において、同じ菌株を用いた場合でも共生発芽能に違いがあることが観察されたが、これは、継代培養中に菌株内の感染ウイルスに変異が生じたことが要因となっている可能性が考えられる。このような菌株については、菌糸の大量培養を行い、精製したdsRNAについてRNAseqを利用した網羅的なウイルス解析を行うことを検討する。これまでの研究では、レブンアツモリソウ無菌培養物から検出されたpartitivirusと共生菌から検出されたpartitivirusとの類縁関係が示唆されている。無菌培養物についてはさらにサンプル数を増やし、類縁ウイルスの存在についてRNAseqやPCRでさらに確認する必要がある。また、継続的な共生培養によってウイルス断片が移行する可能性についても共生培養物と無菌培養物を用意して精査する必要がある。レブンアツモリソウ共生菌にはpartitivirus以外にも複数のマイコウイルスが存在することが分かったが、これによってウイルス感染による宿主菌の共生発芽能への影響はより複雑化している。継代培養や他の方法によって感染ウイルスが異なる変異株を作出し、その後の発芽試験を行うことで、どのウイルスが最も共生菌としての性質に影響を及ぼすのかを決定づけることを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在進行中で行なっている、様々な菌株やレブンアツモリソウサンプルのRNAseqについて、必要となるデータの委託解析費用として支出する予定である。
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