| 研究課題/領域番号 |
17K19277
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
雑賀 啓明 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (20435613)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 育種学 / バイオテクノロジー / 遺伝学 / ゲノム |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、人工制限酵素であるCRISPR/Cas9を利用することで、減数分裂組換え位置を人為的に改変するための技術を開発することを目指す。本年度は、以下の2課題について研究を実施した。
課題1．可視的かつ簡便に減数分裂組換えイベントを検出できるシステムの構築
本課題では、塩基欠失等により機能が欠損したルシフェラーゼ（LUC）遺伝子をbiallelicに有するイネを作出することを目的とする。昨年度までに、LUC遺伝子が１コピー導入されたイネ（品種日本晴）カルスに対し、LUC遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9発現ベクターを導入した。これらのカルスの一部では、ルシフェリンによる発光が観察されず、LUC遺伝子に変異が導入されていることが考えられた。本年度は、それらのカルスから再分化個体を得た。また、LUC遺伝子に導入された変異を決定し、候補系統を選抜した。また、シロイヌナズナでも同様の系統を作出するため、形質転換実験を開始した。
課題2．減数分裂期にCRISPR/Cas9を発現させるシステムの開発
本課題では、減数分裂期にCRISPR/Cas9を発現させるベクターを構築することを目的とする。昨年度までに、減数分裂期で特異的に発現すると予想されるプロモーター領域の下流にCas9遺伝子及びガイドRNA、もしくはGUS遺伝子を連結したベクターを構築した。今年度は、これらの発現カセットをバイナリーベクターへクローニングした。これらのベクターをイネ（品種日本晴）に形質転換を行い、いずれも再分化個体を得た。Cas9発現カセットを形質転換した系統については、カルスまたは幼苗で標的配列に変異が導入されていない個体を選抜し、鉢上げを行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ベクター構築と形質転換にやや時間を費やしたが、特に問題なく進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
課題1「可視的かつ簡便に減数分裂組換えイベントを検出できるシステムの構築」においては、昨年度までに得られた系統を交配し、biallelicに変異が導入された系統を得る。また、課題2「減数分裂期にCRISPR/Cas9を発現させるシステムの開発」においては、得られた後代個体を解析し、減数分裂期特異的プロモーターとして最適なものを選抜する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
塩基配列を決定しなくてはいけない形質転換イネの系統数を絞ったこと、また、プロトコールの改良により解析に必要な試薬類を節約することができたことから、次年度使用額が発生した。次年度は研究の加速化のため、人件費に使用することを検討している。
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