| 研究課題/領域番号 |
17K19296
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
亀井 一郎 宮崎大学, 農学部, 教授 (90526526)
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| 研究分担者 |
津山 濯 宮崎大学, 農学部, 助教 (40786183)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 白色腐朽菌 / 細胞外ベシクル / 分泌 / ナノ粒子 / 木材腐朽 |
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| 研究実績の概要 |
29年度までに白色腐朽菌Trametes versicolor菌糸体の液体培養物を超遠心分離を用いて段階的に分画し、得られたフランクションから透過型電子顕微鏡を用いてナノベシクル様粒子の検出に成功した。30年度は、より自然環境での状態に近いと考えられる固体培地による培養を行い、ナノベシクルの分画と検出を試みた。PDA培地、Kirk-LN/HN寒天培地の3種類の固体培地上にメンブレンを置き、その上に菌糸を植菌した。培養後はメンブレンを剥がすことで固体培地上の菌糸を回収した。回収した菌糸を50 mM クエン酸バッファー（pH4.5)で振盪して細胞外分泌物を抽出し、液体培養時と同様に超遠心分離による分画によりペレットを得た。得られたペレットは洗浄後、ショ糖密度勾配法によって精製した。固体培地上で培養した菌糸をメンブレンごと包埋し電子顕微鏡で観察したところ、細胞外にベシクル構造が確認できた。そこで、ネガティブ染色によってペレット懸濁液を観察したところ、直径20～300 nmほどのベシクル構造が多数観察された。これは3種類すべての寒天培地において共通していたが、Kirk-LN寒天培地由来のナノベシクルは直径の大きいもの（130～290 nm）の頻度が高かった。これらの結果から、固体培地において、T. versicolorはEVを分泌しており、培養環境が変わるとその形態が変化することが明らかとなった。液体培養からナノベシクルを調製すると、検出頻度が非常に低かったのに対し、今回確立した固体培地からのナノベシクルの調製では高頻度にナノベシクルを観察することができたことから、糸状菌におけるナノベシクル研究の基盤ができたと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
白色腐朽菌からナノベシクルを検出する方法の確立が最大の焦点であったが、29年度に成し遂げられなかったナノベシクルの検出に、30年度は分画法、ペレットの洗浄法、ショ糖密度勾配による精製等の検討を進めることで成功した。もっとも影響していると考えられるのは培養条件であり、白色腐朽菌を含む糸状菌がより自然状態に近いと考えられる固体培養に切り替えることで高頻度に検出することができたのは本研究の遂行上大きい成果である。一方で、得られたナノベシクルに内包されている検出には至っていない。この点をさらに検討する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
固体培養によりナノベシクルの検出には成功したが、内包されているタンパク質の同定に至っていない、これは分泌タンパク質が必要な培養条件を構築できていないことが理由の一つと考えられることから、さらに自然条件に近い培養機材として広葉樹木粉を用いた固体培養物からのナノベシクル検出と内包タンパク質の検出を行う。具体的には、30年度に確立した寒天培地上に設置したメンブレンからナノベシクルを抽出する方法を応用し、木粉を含む寒天培地を用いる。また、木粉そのものを白色腐朽菌で腐朽し、そこから直接ナノベシクルを抽出することも試みる。この実験により、木質分解に関連する酵素の分泌が盛んな条件下で分泌されるナノベシクルを得られると仮説を立てており、その検証を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進行過程で、特にタンパク質検出にかかる生化学試薬の必要性が遅延したため次年度使用額が生じた。翌年度に計画通り使用する。
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