| 研究課題/領域番号 |
17K19329
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
乾 隆 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80352912)
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| 研究分担者 |
石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
西村 重徳 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 助教 (90244665)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | イヌアレルギー / リポカリンアレルゲン / IgE / X線結晶構造解析 / アレルゲンとエピトープ |
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| 研究実績の概要 |
Ⅰ型アレルギーは，好塩基球やマスト細胞上のIgE抗体とアレルゲンが架橋することにより惹起される即時型の過敏症であり，主な治療法として抗アレルギー薬が用いられるが，症状の緩和が目的であるため完治は見込めない。一方，完治が見込める治療法として，低濃度のアレルゲンを直接体内に投与しアレルギー反応を寛容化に導くアレルゲン免疫療法があるが，本法はアレルゲンを直接体内に投与する治療法であるため，重篤な副作用であるアナフィラキシーを引き起こす危険性がある。より安全にアレルゲン免疫療法を行うためには，アナフィラキシー活性を低下させた低アレルゲン化ワクチンの開発が必須である。
そこで我々は，先進国において患者数が急増しているⅠ型アレルギーのイヌアレルギーに注目し，IgE抗体との結合親和性を低下させた低アレルゲン化ワクチンの開発を目指した。
本研究では，同定されている7種のイヌアレルゲンの中で最もアレルゲン活性が高いCanis familiaris allergen 1（Can f 1）と，他の動物由来アレルゲンとのアミノ酸配列相同性が高く，交差反応性を有することが報告されているCan f 6の２種のアレルゲンを研究に用いた。
Can f 1では，IgEエピトープ予測サーバーを利用して，B細胞エピトープを予測した。予測したアミノ酸残基をアラニンに置換した変異型Can f 1を作製し，変異型Can f 1のIgE結合親和性，及びラット培養マスト細胞株RS-ATL8細胞を用いて，変異型Can f 1による脱顆粒能を評価した。
Can f 6では，X線結晶構造解析により立体構造を決定した後，交差反応性が報告されてるネコアレルゲンFel d 4，及びウマアレルゲンEqu c 1のアミノ酸配列を利用してIgE抗体とアレルゲンとの結合部位であるB細胞エピトープを予測し，本エピトープを欠損させた変異体を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Can f 1では，アレルゲンの交差反応性とIgEエピトープ予測サーバーを用いて得られたアミノ酸残基をAlaに置換した6種類の変異型Can f 1を作製した。ELISAによりイヌアレルギー患者血清中のIgEとの結合親和性を評価したところ，R152Aが野生型Can f 1と比較してIgE結合親和性が約10％低減した。また，多重変異型Can f 1（R152A/K49A, R152A/H86A, R152A/R111A）を作製し，同様の実験を行った結果，R152A/R111Aが18%の低減を示した。次に，ラット培養マスト細胞株RS-ATL8細胞を用いて，野生型及び変異型Can f 1の脱顆粒能を測定した結果，多重変異型Can f 1は，野生型Can f 1と比較して有意に脱顆粒能が低減されることが判明し，特にR152A/R111Aが最も脱顆粒能の低減を示した。
一方，Can f 6では，Can f 6の結晶化とX線結晶構造解析（SPring-8）を行ったところ，分解能2.35Åの結晶構造を得ることができた。Can f 6の立体構造は，リポカリンファミリーで高度に保存されたβ-barrel構造とそれに付随するα-helix構造を有した構造であることが判明した。次に，Can f 6のIgEエピトープを同定するために，得られた立体構造とネコアレルゲンFel d 4，及びウマアレルゲンEqu c 1との交差反応性を利用し，上記3種間でアミノ酸配列のアラインメントを行った。その結果，高度に保存された領域を同定することができ，その領域内のアミノ酸残基をIgEエピトープと予測した。次に，予測した領域をCan f 6の立体構造上にマッピングし，溶媒面に露出しているアミノ酸残基を選択し， Can f 6のIgEエピトープとして絞り込み，それらのアミノ酸残基をAlaに置換した変異体を作製した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Can f 1については, 引き続き結晶化の条件を検討する。結晶化条件の検討は，Can f 6の結晶化条件を参考にし，HAMPTON社の結晶化スクリーニングキットを用いて行う。次年度に行う予定であったELISA法によるイヌアレルギー患者血清中のCan f 1特異的IgE抗体価の測定，及びRS-ATL8を用いた野生型及び変異型Can f 1のin vitroアレルゲン活性の評価に関しては，本年度に終了していることから，次々年度に実施を予定していた変異型Can f 1を用いたアレルギー免疫療法の評価を前倒しで行う。野生型Can f 1をアジュバンド（水酸化アルミニウム）と共にマウス腹腔内に投与することにより免疫感作を行い，イヌアレルギーモデルマウスを作製する。免疫感作終了後，変異型Can f 1をマウス腹腔内に投与し，末梢血を採取する。末梢血中の抗体，及び各種サイトカインを定量するとともに，可能ならばフローサイトメトリーを用いてCD4+CD25+T細胞（制御性T細胞，Treg）の割合を測定し，イヌアレルギーモデルマウスにおける免疫寛容の誘導（アレルゲン免疫療法の効果）の有無を確認する。
一方，Can f 6については，立体構造と交差反応性を利用し，IgEエピトープと予測される残基をAlaに変異した変異体Can f 6が得られているので，予定通りにELISA法によるイヌアレルギー患者血清中のCan f 6特異的IgE抗体価の測定とRS-ATL8を用いた野生型および変異型Can f 6のin vitroアレルゲン活性の評価を行う。さらに，可能ならば，変異型Can f 1を用いたアレルギー免疫療法の評価と同時に，変異型Can f 6を用いたアレルギー免疫療法の評価も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
想定していた以上に研究が順調に進んだため、必要としていた試薬類の購入を大幅に節約することができた。次年度の申請額にこれらの予算を加えることで、よりスピーディーに本申請研究を進めることが可能になる。
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