|
平成２９年度 - ＤＮＡ合成中にリボヌクレオチドを高頻度に取り込む変異をPOLE1とPOLD1遺伝子（Polε，Polδのカタリティック因子ををコードする遺伝子）に導入した細胞株を樹立した．POLE1に関しては相同染色体の両遺伝子座，POLD1遺伝子座には一方の遺伝子座にのみ導入が行われた．その後，ゲノムＤＮＡ上でのrNMPの除去を抑制するために，siRNAを使用したノックダウンにより，ゲノムＤＮＡ中のリボヌクレオチドを除去する酵素であるRNaseH2の不活化を試みたが，その効率は十分ではなかった．よって，薬剤により標的となるタンパク質の分解誘導を行う方法(AIDタンパク質分解法；Nishimura et al. Nat Methods 6 917-22 2009）を応用し，細胞内でRNaseH2の迅速な分解を誘導する系を上記のポリメラーゼの変異体に導入した．
平成３０年度 - 平成２９年度に樹立した細胞からゲノムＤＮＡを回収後，アルカリ処理によりrNTP部位での切断を誘導した．ＤＮＡ鎖中のrNMP取り込みの有無を処理後の断片化の程度を電気泳動で確認し，その断片を回収した．このＤＮＡ断片から次世代シークエンサー解析用にライブラリＤＮＡを作成し，配列解析を行った結果，両遺伝子座に変異度導入が行われたPolεに関してだけであるが，全ゲノム網羅して，ＤＮＡポリメラーゼの合成ファイルを得ることができた．
|
