| 研究課題/領域番号 |
17K19438
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
林 朗子 (高木朗子) 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (60415271)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| キーワード | シナプス / 機能的コネクトミクス / シナプス光遺伝学 |
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| 研究実績の概要 |
コネクトミクスとは、神経系内の神経細胞間の詳細な接続状態を表した地図、つまりシナプスを接続部とした詳細な神経回路地図のことであり、電子顕微鏡の3D再構築画像を用いた「形態的」コネクトミクスが欧米で精力的に推進されています。一方で、如何に詳細な地図を作ろうとも、どの神経神経回路が実際に使用され、強化もしくは減弱されたかを示すことは出来ません。そこで、シナプスの可塑性の情報を含めた「機能的」コネクトミクスは今後必要な技術と思われます。申請者は、神経活動依存性に増大もしくは新生した興奮性シナプスのシナプス後部（樹状突起スパイン）を特異的に標識するAS-PaRac1を作成し、スパインの形態可塑性を大規模に標識する技術開発に従事してきました。しかし、AS-PaRac1はシナプス後部だけを標識し、神経回路における主要な可塑性がシナプスの前部と後部の同調した活動（Fire together, wire together）が必要であることを考えれば、シナプスの前後を同時かつ2重に標識することでより精度の高い「機能的」コネクトミクスが達成出来るはずです。試験的に子宮内電気穿孔法でAS-PaRac1とともにシナプス前部マーカー（mTurquoise fused VAMP2, mTq-VAMP2）、神経形態マーカー（Filler、Venus）を活動依存的に発現させると、神経活動依存的にシナプス前部および後部を標識できることが示されました。そこで、これら3コンストラクトを発現するトリプル・トランスジェニックマウスを作成し適正な系統を選別、徹底的に特性解析します。このマウスと透明化などの最先端イメージング技術を組み合わせることで、シナプス可塑性を定量的に大規模に検出することが可能になり、各種学習モデルや疾患モデルに適応することで、新規の機能的コネクトミクスの技術基盤の開発に挑戦します。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の骨子は、シナプス前部マーカー、シナプス後部マーカー、シナプス後部神経形態マーカーの3つの蛍光プローブを発現するトリプルトランスジェニックマウスを作成することであり、複数のコンストラクを作成し、各々の発現効率や蛍光蛋白質としての安定性、他の脳領域への輸送に必要な時間などを定量化し、最適のコンストラクトの選出を終了した。現在、上記3つのトランスジーンを発現するトランスジェニックマウスを作成している最中であり、実験の進捗状況は、当初予定したペースで進行している。加えて、H30年度に用いる行動実験に関しても準備が進行しており、全体的に見ても、順調と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
発現する神経細胞種、標識細胞密度、発現量の観点から、適正にシナプス前部および後部が標識されるマウスのラインを選出します。シナプス前部マーカーであるDIO-mTq-VAMP2は約100％に迫る遺伝子導入効率を示し、シナプス後部を標識するAS-PaRac1とFillerは比較的まばらに標識する系統を選び出します。灌流固定による切片標本とin vivo 2光子励起観察を組み合わせスクリーニングします。本研究室で扱う前頭野領域（PFC）において、活動に応じてAS-PaRac1が新生・増大した記憶スパインを特異的に標識すること、異なる脳領域間におけるシナプス前部および後部が適切な標識密度であること、最後にスパインを特異的に光学的消去できるかを確認し、新規イメージング技術に耐えうるTGマウスとして特性解析します。このマウスと透明化などの最先端イメージング技術を組み合わせることで、シナプス可塑性を定量的に大規模に検出することが可能になります。使用する行動モデルはSocial defeat model（SDS）をPTSDモデルとして適応することで、新規の機能的コネクトミクスの技術基盤の開発に挑戦します。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述したとおり、H29年度は数多くのDNAコンストラクトを作成・選別する分子生物学的作業を行い、少量の消耗品しか必要とせず、既に研究室で所有する消耗品の一部を使用するだけで事足りるレベルであった。一方で、現在はトランスジェニックマウスを作成している最中であり、この経費の支払いはH30年度になり、3系統のマウス作成のために合計240万円を計上している。更に、このファウンダーマウスの組織解析や行動実験には多くの実験が伴うことが想定され、そのための物品費に160万円、マウスの管理維持のための研究補助員の人件費に100万円、500万円を予定している。
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