| 研究課題/領域番号 |
17K19465
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
岡田 洋平 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (30383714)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 神経変性疾患 / ポリグルタミン病 / 根治的治療法 |
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| 研究実績の概要 |
（1）培養細胞株におけるCAGリピート編集
CRISPR/Cas9を用いて、ヒト筋芽細胞株：Hu5/KD3におけるCAGリピート編集（ゲノム編集）を行った。すなわち、ゲノム二本鎖切断酵素（ヌクレアーゼ）である化膿性連鎖球菌由来SpCas9、標的の配列を認識させるガイドRNA（sgRNA）、ゲノムにノックインするARの伸長CAGリピート配列（AR55Q, 97Q）を含むDonor DNAを細胞に導入して薬剤選択を行い、CAGリピートの伸長したノックイン株を樹立した（AR24Q→AR55/97Q）。クローン選択後に、PiggyBac transposaseを用いて、ゲノム/Donor DNA中に挿入された薬剤選択カセットを除去した。現在、樹立した株を用いて、骨格筋分化についての解析を進めている。
（2）SBMA疾患特異的iPS細胞におけるCAGリピートの短縮
同様の方法でSBMA疾患特異的iPS細胞におけるCAGリピート編集（短縮：AR55Q→AR24Q）を行った。薬剤カセット除去後のクローンにおいて、PCRおよびシークエンス解析によるノックイン、および薬剤選択カセット除去の確認、および、RT-PCR、Western blottingによる正常ARの発現確認を進めている。今後、ゲノム編集後のiPS細胞を運動ニューロンへと分化誘導し、SBMA患者由来運動ニューロンでこれまでに観察されている表現型のレスキューを解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞株におけるゲノム編集は成功しており、またヒトiPS細胞のゲノム編集についても、概ね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
SBMA疾患特異的iPS細胞では、ゲノム編集後の細胞におけるシークエンス、および発現チェックによるCAGリピートの正常化を確認できたら、CAGリピートを正常化したiPS細胞を運動ニューロンへと分化誘導し、表現型のレスキューの解析へと進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
効率的に実験を進められたため、次年度使用額が生じた。翌年度分と合わせて、実験試薬や実験器具等の消耗品の購入、研究技術員の雇用等にあてる予定である。
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