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2018 年度 実施状況報告書

翻訳後修飾酵素活性のライブイメージングを実現するcoupled蛍光プローブの開発

研究課題

研究課題/領域番号 17K19477
研究機関東京大学

研究代表者

小松 徹  東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任助教 (40599172)

研究期間 (年度) 2017-06-30 – 2020-03-31
キーワードケミカルバイオロジー / 創薬化学
研究実績の概要

本研究は,生体内の酵素活性を直接観察することを可能とする研究ツールの開発を目的として,特に,タンパク質のアミノ酸側鎖の化学修飾によってその機能を改変する翻訳後修飾を担う種々の酵素群の活性を,タンパク質,プローブペアにより検出するcoupled assayの仕組みの構築を目指しておこなわれてきた.
研究計画に記載のとおり,ウィルス由来の高選択的プロテアーゼであるTEVプロテアーゼの基質認識能を精査し,これを用いた新たなcoupled assayの仕組みについて立ち上げをおこなった.また,これと併せて,当初の計画では予定していなかった新たな側面からの研究展開として,プロテアーゼを利用したisoaspartyl基のメチル化反応の可視化プローブを細胞内補酵素の検出系に利用することで,広範なメチル基転移酵素の活性を評価することができる新たなcoupled assay系を立ち上げることに成功した.加えて,この検出系を利用して,細胞内のメチル化ポテンシャルの変化を生細胞レベルで検出する実験系を構築し,これを用いた生細胞スクリーニング系の立ち上げまでを達成した.

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

ウィルス由来の高選択的プロテアーゼであるTEVプロテアーゼの基質構造を精査するペプチドライブラリを構築し,その構造活性相関,特に,生体内で重要性を有する翻訳後修飾の可視化に資する基質構造修飾の可能性について明らかにすることに成功した.
研究計画に記載のとおり,isoaspartyl基のメチル化反応をcoupled assayによって検出する蛍光プローブについて,構造最適化を実施し,従来よりも1オーダー程度高いS/N比をもってこれを検出することができる蛍光プローブの開発を達成した.特に,この蛍光プローブがメチル化反応の可視化を高選択的に可能とするという性質に基づき,メチル化反応の補酵素として用いられるS-adenosylmethionine(SAM)の量変化を検出する実験系へとこれを転用し,その開発を達成した.近年の研究から,細胞内のメチル化反応の反応性は,その補酵素であるSAM濃度によってグローバルな制御を受けている可能性が示唆されており,SAM濃度変化は恒常性の維持,疾患の成り立ちにおいて重要な役割を果たすエピジェネティックな制御因子のひとつとして位置づけられている.本研究を通じて,ペプチド性のプローブを細胞内に導入することが困難であるという新たな課題が見出され,この点を克服することは困難であったが,代わりに,細胞を可溶化すると同時に,ここで起こる反応を可視化する実験系をもって細胞内の補酵素の検出を可能とすることに成功し,実際に,細胞の状態の変化に応じたメチル化ポテンシャルの変動をハイスループットに評価することが可能であることが確かめられた.一連のアッセイ系の確立とその応用について,現在論文投稿準備中となっている.

今後の研究の推進方策

本研究を通じて,ペプチド性のプローブと選択的プロテアーゼを利用したcoupled assayの仕組みについて確立することを達成したが,開発した多くのペプチド性プローブについて,細胞膜透過性を実現することが当初の予定以上に困難であることが明らかとなった.この点については,細胞の可溶化と併せることで準生理的な条件下での解析を可能としたが,より生理的な条件での変化をモニターするプローブ群を安定的に開発するためには,更なるプローブ群の開発による知見の蓄積が望まれる.一方で,本研究室を通じて,各種翻訳後修飾の可視化を可能とするアッセイ系の開発をおこなっただけでなく,これを制御する化合物を取得するためのスクリーニング系を立ち上げることまでを達成し,特に,表現型の制御において重要な役割を果たすヒストンのメチル化状態を制御することが期待される薬剤候補の取得に成功した.これらの機能を精査すると共に,構造展開をおこなって,疾患の理解と制御を可能とするケミカルバイオロジーの研究ツールとして発展させていくことが強く望まれる.

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件、 招待講演 10件)

  • [雑誌論文] Development and validation of an improved diced electrophoresis gel assay cutter-plate system for enzymomics studies2019

    • 著者名/発表者名
      Komatsu Toru、Shimoda Masahiro、Kawamura Yukiko、Urano Yasuteru、Nagano Tetsuo
    • 雑誌名

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics

      巻: 1867 ページ: 82-87

    • DOI

      10.1016/j.bbapap.2018.06.004

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure pH Values in Living Samples2018

    • 著者名/発表者名
      Takahashi Shodai、Kagami Yu、Hanaoka Kenjiro、Terai Takuya、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Uchiyama Masanobu、Koyama-Honda Ikuko、Mizushima Noboru、Taguchi Tomohiko、Arai Hiroyuki、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 140 ページ: 5925-5933

    • DOI

      10.1021/jacs.8b00277

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia2018

    • 著者名/発表者名
      Hanaoka Kenjiro、Kagami Yu、Piao Wen、Myochin Takuya、Numasawa Koji、Kuriki Yugo、Ikeno Takayuki、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Terai Takuya、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
    • 雑誌名

      Chemical Communications

      巻: 54 ページ: 6939-6942

    • DOI

      10.1039/c8cc02451k

    • 査読あり
  • [雑誌論文] High-throughput single-molecule bioassay using micro-reactor arrays with a concentration gradient of target molecules2018

    • 著者名/発表者名
      Watanabe Rikiya、Komatsu Toru、Sakamoto Shingo、Urano Yasuteru、Noji Hiroyuki
    • 雑誌名

      Lab on a Chip

      巻: 18 ページ: 2849-2853

    • DOI

      10.1039/C8LC00535D

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Red-Shifted Fluorogenic Substrate for Detection of lacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution2018

    • 著者名/発表者名
      Ito Hiroki、Kawamata Yu、Kamiya Mako、Tsuda-Sakurai Kayoko、Tanaka Shinji、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Hanaoka Kenjiro、Okabe Shigeo、Miura Masayuki、Urano Yasuteru
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 57 ページ: 15702-15706

    • DOI

      10.1002/anie.201808670

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Rapid detection of metastatic lymph nodes of colorectal cancer with a gamma-glutamyl transpeptidase-activatable fluorescence probe2018

    • 著者名/発表者名
      Kubo Hidemasa、Hanaoka Kenjiro、Kuriki Yugo、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Kojima Ryosuke、Kamiya Mako、Murayama Yasutoshi、Otsuji Eigo、Urano Yasuteru
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 17781-6942

    • DOI

      10.1038/s41598-018-36062-3

    • 査読あり
  • [学会発表] 酵素活性の網羅的解析(enzymomics)による疾患関連タンパク質の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      レドックス研究会 2018
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of enzymomics approach to search for disease-related alternation of enzymatic functions2018

    • 著者名/発表者名
      Toru Komatsu
    • 学会等名
      Mass Spectrometry and Proteomics (MSP) 2018
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] ペプチド代謝活性の網羅的解析(enzymomics)による新規疾患関連タンパク質の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」第1回若手シンポジウム
    • 招待講演
  • [学会発表] ペプチド代謝活性の網羅的解析(enzymomics)による疾患関連タンパク質の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      第69回日本電気泳動学会総会シンポジウム
    • 招待講演
  • [学会発表] 酵素活性の網羅的解析(Enzymomics)法による疾患関連タンパク質の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      第56回生物物理学会年会
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of enzymomics approach to search for disease-related alternation of enzymatic functions2018

    • 著者名/発表者名
      Toru Komatsu
    • 学会等名
      ICPAC Langkawi 2018
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 酵素活性の網羅的評価(enzymomics)による新規疾患関連タンパク質の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      第41回日本分子生物学会年会
    • 招待講演
  • [学会発表] Diced Electrophoresis Gel (DEG) 法を用いた癌細胞における活性異常酵素の探索2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      第38回 キャピラリー電気泳動シンポジウム (SCE2018)
    • 招待講演
  • [学会発表] 分子夾雑の理解に基づく癌関連タンパク質のオルガネラ膜局時局在機構の解明と制御2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      新学術領域研究「分子夾雑の生命化学」関東地区シンポジウム
    • 招待講演
  • [学会発表] 酵素のはたらきを「視る」手法を開発して新たな疾患関連タンパク質を「探す」2018

    • 著者名/発表者名
      小松徹
    • 学会等名
      ITbM/IGER Chemistry Workshop 2018 - Exploring the Science with Molecules
    • 招待講演

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公開日: 2019-12-27  

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