新規薬物の依存性や報酬効果の予測が可能なin vivo評価系の構築

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19483
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 永井 拓 名古屋大学, 医学部附属病院, 准教授 (10377426)
• 研究分担者: 伊藤 教道 名古屋大学, 医学部附属病院, 特任助教 (30726310)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2019-03-31
• キーワード: 薬理学 / 可視化 / 薬物反応性

研究実績の概要

新規薬物の依存性や報酬効果の予測は行動薬理学的試験が実施されているが、これらの行動試験では特殊技術や実験装置が必要であり、実験結果を得るまでに長期間を要する。より簡便に薬物の依存性や報酬効果を予測できる実験手法の開発が望まれている。依存性薬物は脳内の報酬回路を活性化して報酬効果を示すことが知られており、中脳腹側被蓋野から側坐核に投射する中脳辺縁系ドーパミン作動性神経系は報酬回路を構成する重要な神経系の一つである。細胞外に放出されたドーパミンは側坐核の投射神経である中型有棘神経細胞（medium spiny neurons, MSNs）に作用する。ドーパミンD1受容体（D1R）を発現するMSNs（D1R-MSNs）は、複数の神経入力を統合して情報を出力するインテグレーターとして機能し、D1R-MSNsの活性化は報酬効果（快感）に関する情報を制御している。コカインやモルヒネなど依存性薬物の作用部位はそれぞれ異なるが、いずれの薬物もD1R-MSNsの細胞活動とそれに続く遺伝子の転写調節を介して精神依存を形成すると考えられている。遺伝子の転写量はプロモーターやシグナル応答配列などの転写調節領域によって調節される。レポーターアッセイは転写因子の応答配列をルシフェラーゼや蛍光蛋白質などのレポーター遺伝子に付加することで転写活性を容易に測定することができる実験系であり、培養細胞系で汎用されている方法である。この手法をマウスに応用し、生きた状態で特定の神経細胞集団のレポーターアッセイを行えるシステムを開発すれば新規薬物の依存性や報酬効果を予測できると考えられる。以上のことを鑑み、本研究ではD1R-MSNsの転写活性をin vivoで、簡易に、且つリアルタイムに可視化してモニターできるシステムの構築を目指した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成29年度はin vivoリン酸化プロテオミクス解析および転写因子応答配列のスクリーニングを行った。
1）in vivoリン酸化プロテオミクス解析：申請者は、マウス線条体スライス標本を用いてドーパミンD1RやプロテインキナーゼA（PKA）の刺激で活性化されるリン酸化シグナルを同定し（Nagai et al. Neuron 2016）、これらリン酸化基質の情報を管理するデータベースKANPHOSを作成し公開した。KANPHOSには、スライス標本上で特定の受容体を刺激することで得られたリン酸化基質が登録されており、シグナル解析を行うことが出来る。本研究では、始めにマウスの側坐核で起こるリン酸化反応を探索し、コカインを処置した際にPKAを介するシグナル経路が活性化されることを確認した。
2）転写因子応答配列のスクリーニング：リン酸化プロテオミクス解析から同定された転写シグナルの情報を基に、転写因子の応答配列をリストアップし、応答配列とルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルス（AAV）を作製した。培養細胞を用いてin vitroのスクリーニングを実施し、PKA活性化薬の処置によりルシフェラーゼの発現が増加することを確認した。スクリーニングの結果を基に、転写因子応答配列の候補を絞り込み、至適化を行った。

今後の研究の推進方策

3）in vivo解析系の開発：至適化が完了した候補については、Cre recombinase依存的に機能するAAVを作製する。作製したAAVをD1R遺伝子プロモーターの下流でCre recombinaseを発現するトランスジェニックマウスの側坐核に注入し、D1R-MSNsで特異的にルシフェラーゼを発現するマウスを作製する。さらに、このマウスにコカインを投与してin vivoイメージャーによる化学発光測定を行い、側坐核D1R-MSNsのルシフェラーゼ活性を時空間的にモニターできるようにin vivoレポーターアッセイの実験条件を確立する。
4）薬物反応性のモニタリング：評価系としての妥当性を検証するために、依存性薬物や非依存性が確認されている薬物を作製したマウスに投与して薬物反応性をモニターする。特に法的規制がある薬物（メタンフェタミン、テトラヒドロカンナビノールなど）、乱用により依存が生じる処方薬（メチルフェニデート、モルヒネ、ジアゼパム、ケタミンなど）、嗜好品に含まれる薬物（アルコール、ニコチン）、抗精神病薬（ハロペリドール、クロザピン）や抗うつ薬（イミプラミン、フルオキセチン）などについて調べる。

研究成果

• [雑誌論文] Astroglial major histocompatibility complex class I following immune activation leads to behavioral and neuropathological changes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sobue, A., Ito, N., Nagai, T., Shan, W., Hada, K., Nakajima, A., Murakami, Y., Mouri, A., Yamamoto, Y., Nabeshima, T., Saito, K., Yamada, K.
  • 雑誌名: Glia 巻: 66 ページ: 1034-1052
  • DOI: 10.1002/glia.23299.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuronal PAS domain protein 4 (Npas4) controls neuronal homeostasis in pentylenetetrazole-induced epilepsy through the induction of Homer1a. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shan, W., Nagai, T., Tanaka, M., Itoh, N., Furukawa-Hibi, Y., Nabeshima, T., Sokabe, M., Yamada, K.
  • 雑誌名: J. Neurochem. 巻: 145 ページ: 19-33
  • DOI: 10.1111/jnc.14274.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. (2018)
  • 著者名/発表者名: Wulaer, B., Nagai T., Sobue, A., Itoh, N., Kuroda, K., Kaibuchi, K., Nabeshima, T., Yamada, K.
  • 雑誌名: Gene Brain Behav. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Exposure to diphtheria toxin during the juvenile period impairs both inner and outer hair cells in C57BL/6 mice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Konishi A, Ohgami N, Matsushita A, Kondo Y, Aoyama, Y, Kobayashi M, Nagai, T,, Ugawae S, Yamada K, Kato M, Kiyama H.
  • 雑誌名: Neuroscience. 巻: 351 ページ: 15-23
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2017.03.028.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo, K.I., Deguchi, K., Nagai, T,, Ito, Y., Yoshida, K., Endo, T., Benner, S., Shan, W., Kitazawa, A., Aramaki, M., Ishii, K., Shin, M., Matsunaga, Y., Hayashi, K., Kakeyama, M., Tohyama, C., Tanaka, K.F., Tanaka, K., Takashima, S., Nakayama, M.
  • 雑誌名: JCI Insight. 巻: 2 ページ: 88609
  • DOI: 10.1172/jci.insight.88609
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Valocin-containing protein (VCP) is a novel IQ motif containing GTPase activating protein 1 (IQGAP1) interacting protein. (2017)
  • 著者名/発表者名: Itoh, N., Nagai, T,, Watanabe, T., Taki, K., Nabeshima, N., Kaibuchi, K., Yamada, K.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 493 ページ: 1384-1389
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.09.159.
  • 査読あり
• [学会発表] ホメオスタシスの観点から考えるてんかん治療の標的分子. (2018)
  • 著者名/発表者名: 永井拓, Shan Wei, 山田清文.
  • 学会等名: 日本薬学会第138年会
  • 招待講演
• [学会発表] ドパミン神経伝達により引き起こされる神経興奮と報酬関連行動の細胞内シグナル. (2017)
  • 著者名/発表者名: 永井拓, 黒田啓介, 貝淵弘三.
  • 学会等名: 第40回日本神経科学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] Npas4 mediates pentylenetetrazole-induced Homer1a expression in the hippocampus. (2017)
  • 著者名/発表者名: 2.永井拓, Shan Wei, 田中基樹, 鍋島俊隆, 曽我部正博, 山田清文.
  • 学会等名: 第60回日本神経化学会大会
• [学会発表] 脳機能を制御するリン酸化シグナルの解明に関する研究. (2017)
  • 著者名/発表者名: 永井拓
  • 学会等名: 第60回日本神経化学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] ペンチレンテトラゾール誘発てんかん発作におけるNpas4の役割. (2017)
  • 著者名/発表者名: 永井拓, Shan Wei, 田中基樹, 鍋島俊隆, 曽我部正博, 山田清文.
  • 学会等名: 第39回日本生物学的精神医学会・第47回日本神経精神薬理学会合同年会
• [学会発表] Phosphorylation signals in reward-motivated behaviors. (2017)
  • 著者名/発表者名: 永井拓, 貝淵弘三.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • 招待講演
• [備考] 医療薬学研究室ホームページ
  • URL: https://www.med.nagoya-u.ac.jp/medical_J/laboratory/clinical-pharma/clinical-pharma/neuropsycho-pharmacology/