| 研究課題/領域番号 |
17K19518
|
|---|
| 研究機関 | 大阪市立大学 |
|---|
研究代表者 |
安房田 智司 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (60569002)
|
|---|
| 研究分担者 |
守田 昌哉 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 准教授 (80535302)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
|
| キーワード | 精子 / 精漿 / プロテオーム分析 / 交尾 / 精子競争 / カジカ科魚類 / トゲウオ目 / ウミタナゴ |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、「交尾」や「精子競争」に伴って進化した精子や精漿の分子基盤を解明することである。そこで、近縁種に異なる繁殖生態を持つ魚類を対象に、野外潜水調査、生理学的手法、生化学的手法を用いて、精子や精漿の研究を行った。平成29年度は、(1) 5魚種の繁殖生態の調査と精子の運動性や形態の観察、（2）精子と精漿成分のプロテオーム分析を行った。
（1）5魚種の繁殖生態の調査と精子の運動性や形態の観察：スズキ目近縁2科スズメダイグループ（非交尾種：スズメダイ：交尾種：ウミタナゴ）、トゲウオ目近縁2科（非交尾種：シワイカナゴ、チューブスナウト；交尾種：クダヤガラ）の計5種について、野外観察を行った。どの種も雄が繁殖縄張りを持ち、そこに雌が訪問して産卵または交尾をする種であったが、繁殖方法や個体群密度から、精子競争レベルは、スズメダイ、ウミタナゴ、クダヤガラで比較的高く、シワイカナゴやチューブスナウトで低いと考えられた。精子計測の結果、交尾種では体内と浸透圧が同じ等張液でのみ、非交尾種では海水のみ精子が活発に運動した。これまでのカジカ科魚類と同様に、交尾種は非交尾種に比べて、細長い頭部を持つ傾向にあった。以上のように、交尾種と非交尾種で精子の運動性や形態に明らかな違いが認められた。
（2）精子と精漿成分のプロテオーム分析：これまでに採集した異なる繁殖様式を持つカジカ科魚類の精子および精漿サンプルを用いてプロテオーム分析を行った。二次元電気泳動の結果、精漿成分については、非交尾雄保護型と交尾雄保護型で共通する泳動パターンが見られ、そのうちの幾つかは交尾型で増加していた。一方、雌保護型や卵寄託型では全く異なる泳動パターンを示した。質量分析計を用いてこれらのタンパク質の同定を試みた結果、幾つかは免疫や金属イオンに対する防御の役割を果たすタンパク質と同定された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究内容の（1）5魚種の繁殖生態の調査と精子の運動性や形態の観察については、これまでの研究の蓄積もあり、精子のデータがチューブスナウトを除いて、ほぼ揃ったと言って良い。チューブスナウトについては、アメリカ・モントレー湾で偶然1個体成熟雄の捕獲に成功した。当初の予定では、葛西臨海水族園で飼育している個体を譲り受けて、精子の計測を行う予定であったが、想定外に野外の個体から精子データを採取できたのは嬉しい誤算であった。基本的には、交尾型は等張液のみで精子が運動し、非交尾型は海水のみで精子が運動性を有するという共通の結果が得られたため、本研究により得られた精子特性は魚類に共通するものなのかもしれない。この点では大きな進展と言える。一方で、チューブスナウトの場合、等張液と海水のどちらが溶液の場合でも精子は運動性を持っていた。非交尾型のカジカ数種でも同じ結果が得られているが、理由は不明である。今後詳細に調べていく必要がある。
研究内容の（2）精子と精漿成分のプロテオーム分析については、精漿の二次元電気泳動の結果より、交尾型と非交尾型で精漿成分が大きく異なっていることが明らかとなった。これは当初の予測通りであり、交尾行動の進化が精漿成分にまで大きく影響を与えていることを示している。しかしながら、質量分析計を用いてこれらのタンパク質の同定を試みたが、カジカ科魚類では遺伝子のデータベースが無いため、ほとんどのタンパク質が未知のものと判断された。この結果は想定の範囲内ではあったが、来年度以降、カジカ科魚類の全ゲノム解析、さらには精巣タンパクのRNAseqを行うなど、対策を立てる必要がある。
以上より、困難さを伴い、チャレンジングなテーマではあるものの、おおむね順調に進んでいると判断される。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、スズキ目近縁2科スズメダイグループ（非交尾種：クマノミ、スズメダイ；交尾種：ウミタナゴ）の中のクマノミ、スズキ目近縁2科カサゴグループ（非交尾種：キリンミノ；交尾種：カサゴ）のカサゴについて野外調査および精子の運動性や形態の観察を行う。野外調査は、愛媛県愛南町、静岡県伊豆下田市で行う。愛媛県愛南町では、クマノミの産卵期である6-8月に、カサゴについては交尾期である11-12月にスキューバを用いて採集する。平成29年度と同様に、精子の形態（鞭毛長、頭部形態、中片長）と様々な溶液（海水、卵巣腔液）での精子の運動性（精子寿命、精子の遊泳速度）を調べる。また、北米沿岸に生息しているチューブスナウトについては、これまで1個体のデータしか取れていないため、葛西臨海水族園で飼育している個体を譲り受けて、精子の計測を行う。これまで、キリンミノについては精子の運動性や形態の観察が終了しており、平成30年度で精子の形態や運動性の測定は、予定している全種を終えることができる。
これまで、MALDI-TOF Massを使用した質量分析により、カジカ科魚類で精漿タンパク質の同定を試みたが、現在までの魚類のデータベースでは同定が困難であった。そこで、精漿タンパク質に大きな違いが認められた交尾・卵寄託型のアサヒアナハゼの全ゲノム配列を決定する。すでに個体を採集し、DNAを保存していることから、このDNAを外注に出して次世代シーケンサーで配列を決定する。また、RNAseqにより、精巣で繁殖期特異的に発現しているタンパク質（精子や精漿タンパク質）のRNA配列を決定し、BLAST解析によって配列の同定を行う。今年度はRNAseqの準備のため、カジカ科魚類の繁殖期と非繁殖期に野外採集を行い、それぞれの時期の精巣をRNA Laterで保存し、その後、そのサンプルを用いてライブラリの作成を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度は、筑波大学下田臨海実験所もしくは大阪市立大学で共同研究者との研究打ち合わせを行う必要がある。また、タンパク質の同定のための消耗品が必要となる。そのため、共同研究者に配分されている平成29年度の53,709円を平成30年度に繰り越すこととした。
|
