研究課題
本研究では、受精時に細胞外で機能すると考えられる精子プロテアソームの細胞膜表面への輸送機構とプロテアソーム活性化因子PA200の受精における役割について研究を行った。すでに申請者は、マボヤ精子の卵膜通過に精子プロテアソームがライシンとして細胞外で機能すること、またプロテアソームのα6サブユニットがC末端16残基の切断を受けていることを報告している。また、PA200に関しては、精子形成や生殖に関わるという報告や培養細胞の実験で、細胞外プロテアソームに多く含まれるという報告がある。そこでまず、マボヤ精子細胞膜画分のTriton X-100抽出画分に、抗α6抗体を結合させたProtein A-agarose ビーズで免疫沈降し、SDS-PAGEと電気泳動を行い、バンドを切り出して、LC/MS解析を行った。その結果、プロテアソームのα6サブユニットに加えて、複数のα、βサブユニットや１種の制御サブユニットRpn11のサブユニットが抗α6抗体で特異的に免疫沈降されることが示された。この結果は、少なくとも、精子粗膜画分にプロテアソームが存在し、Triton X100で抽出されることを示している。しかし、この条件で特異的に共沈降される成分で配列既知のタンパク質を同定するには至らなかった。PA200に関してはペプチド抗体を作製したが、ウエスタンブロット解析ではPA200を特異的に認識しなかったのでそれ以上の解析には使用していない。TALENにより遺伝子破壊実験も同時に行なったが、発生異常を引き起こし、PA200欠損精子を得ることはできなかった。一方、プロテーゼという観点では、アスタシン様金属プロテアーゼの阻害剤がマボヤの受精を阻害することを最近見出した。この酵素が精子プロテアソームを活性化する可能性もあり、今後の新展開の手がかりをつかむことができた。
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Scientific Reports
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