ネクロプトーシスとDMAPs放出のライブセルイメージング

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19533
• 研究機関: 東邦大学
• 研究代表者: 中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
• 研究分担者: 村井 晋 東邦大学, 医学部, 助教 (90287540)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2019-03-31
• キーワード: ネクロプトーシス / FRET / SMART / MLKL / RIPK3 / イメージング / トランスジェニックマウス / ２光子顕微鏡

研究実績の概要

我々は昨年度にネクロプトーシスをモニタリングすることのできるSMART(a Sensor for MLKL Activation by RIPK3 based on FRET)と命名したFRET biosensorの開発に成功した。そこで本年度はSMARTを発現するトランスジェニックマウスを樹立するために、ROSA26遺伝子座にCAGプロモーター下流にSMART cDNAを挿入遺伝子断片を導入した。５系統のTgマウスが樹立でき、いずれの系統でもSMART cDNA由来の蛍光タンパク質の発現をWestern blot法にて確認した。まずSMART Tgマウスから採取してきた腹腔マクロファージや、ケラチノサイトにネクロプトーシスを誘導し、FRET/CFP比の上昇が見られるかを検討したが、これらの細胞ではYFPやCFPの蛍光が弱かったために、十分な解析をすることができなかった。そこで次にin vivoでネクロプトーシスを誘導するマウスモデルを検討した。既報の論文にあるように10 ugという大量のTNFを投与することにより誘導される敗血症モデルマウスで、回腸末端から小腸にかけて著明な浮腫が誘導され、組織学的解析から腸上皮細胞にネクロプトーシスの指標となるリン酸化RIPK3のシグナルが検出された。さらにTNF投与により腸上皮障害はMlkl遺伝子欠損マウスで軽減されることから、確かにネクロプトーシスが関与していることを確認した。そこでこのモデルを用いて２光子顕微鏡を用いてin vivoでネクロプトーシスのイメージングを行った。TNF投与によりFRET/CFP比の上昇が認められる傾向にあったものの、CFPの蛍光強度がYFP比較して弱かったことからデータの信頼性に問題が残り、現在他の手法でのSMART Tgマウスの作成を行っている。

研究成果

• [国際共同研究] WEHI(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: WEHI
• [国際共同研究] Cologne University/Kiel University(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Cologne University/Kiel University
• [国際共同研究] Genentech Inc./Washington University/Virginia University(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Genentech Inc./Washington University/Virginia University
• [国際共同研究] Ghent University(ベルギー)
  • 国名: ベルギー
  • 外国機関名: Ghent University
• [雑誌論文] Necroptosis of Intestinal Epithelial Cells Induces Type 3 Innate Lymphoid Cell-Dependent Lethal Ileitis (2019)
  • 著者名/発表者名: Shindo R, Ohmuraya M, Komazawa-Sakon S, Miyake S, Deguchi Y, Yamazaki S, Nishina T, Yoshimoto T, Kakuta S, Koike M, Uchiyama Y, Konishi H, Kiyama H, Mikami T, Moriwaki K, Araki K, Nakano H.
  • 雑誌名: iScience 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.2139/ssrn.3331252
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Blockade of TNF receptor superfamily 1 (TNFR1)-dependent and TNFR1-independent cell death is crucial for normal epidermal differentiation (2019)
  • 著者名/発表者名: Piao Xuehua、Miura Ryosuke、Miyake Sanae、Komazawa-Sakon Sachiko、Koike Masato、Shindo Ryodai、Takeda Junji、Hasegawa Akito、Abe Riichiro、Nishiyama Chiharu、Mikami Tetsuo、Yagita Hideo、Uchiyama Yasuo、Nakano Hiroyasu
  • 雑誌名: Journal of Allergy and Clinical Immunology 巻: 143 ページ: 213～228.e10
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2018.02.043
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of novel methods that monitor necroptosis and the release of DMAPs at the single cell resolution. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakano H, Murai S, Yamaguchi Y, Shirasaki Y, Nakabayashi O, Yamazaki S.
  • 雑誌名: Cell Stress 巻: 3 ページ: 66-69
  • DOI: 10.15698/cst2019.02.177
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Regulation of membrane phospholipid asymmetry by Notch-mediated flippase expression controls the number of intraepithelial TCRαβ+CD8αα+ T cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ishifune C, Tsukumo S, Maekawa Y, Hozumi K, Chung D, Motozono C, Yamasaki S, Nakano H, Yasutomo K.
  • 雑誌名: PLoS Biology 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3000262
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 細胞死亢進の結果ひき起こされる表皮バリア破綻のメカニズム (2019)
  • 著者名/発表者名: 三浦亮介、朴 雪花、中野裕康
  • 雑誌名: 臨床免疫・アレルギー科 巻: 71 ページ: 192～198
• [雑誌論文] 連載 ミニ連載Ⅷ.細胞死と生命システム:生体恒常性の鍵としての細胞自殺 ２.ネクロプトーシス,フェロトーシス,パイロトーシスの分子機構と生体内における機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 三宅早苗、進藤綾大、中野裕康
  • 雑誌名: CLINICAL CALCIUM 巻: 29 ページ: 248～253
  • DOI: 10.20837/4201902248
• [雑誌論文] FRET解析とLCI-Sによるネクロプトーシスのライブセルイメージング (2019)
  • 著者名/発表者名: 村井 晋, 白崎 義隆, 中野 裕康
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 37 ページ: 1315-1321
• [雑誌論文] A murine model of acute lung injury identifies growth factors to promote tissue repair and their biomarkers (2018)
  • 著者名/発表者名: Kurosawa Takeyuki、Miyoshi Shion、Yamazaki Soh、Nishina Takashi、Mikami Tetuo、Oikawa Akira、Homma Sakae、Nakano Hiroyasu
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 24 ページ: 112～125
  • DOI: 10.1111/gtc.12659
  • 査読あり
• [雑誌論文] A FRET biosensor for necroptosis uncovers two different modes of the release of DAMPs (2018)
  • 著者名/発表者名: Murai Shin、Yamaguchi Yoshifumi、Shirasaki Yoshitaka、Yamagishi Mai、Shindo Ryodai、Hildebrand Joanne M.、Miura Ryosuke、Nakabayashi Osamu、Totsuka Mamoru、Tomida Taichiro、Adachi-Akahane Satomi、Uemura Sotaro、Silke John、Yagita Hideo、Miura Masayuki、Nakano Hiroyasu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 ページ: 4457
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06985-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of and characterization of anti-IL-11 antibodies using newly established Il11-deficient mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Deguchi Yutaka、Nishina Takashi、Asano Kenichi、Ohmuraya Masaki、Nakagawa Yoshiko、Nakagata Naomi、Sakuma Tetsushi、Yamamoto Takashi、Araki Kimi、Mikami Tetuo、Tanaka Masato、Nakano Hiroyasu
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 505 ページ: 453～459
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.09.128
  • 査読あり
• [雑誌論文] 細胞死制御のキー蛋白質 (2018)
  • 著者名/発表者名: 進藤綾大、中野裕康
  • 雑誌名: 「医学のあゆみ」特集号「蛋白質代謝医学」 巻: 267 ページ: 1136～1142
• [学会発表] インターロイキン（IL）-11は大腸癌形成を促進するstromal fibroblastsのマーカーとなる (2018)
  • 著者名/発表者名: 仁科隆史、出口裕、竹田若水、中野裕康
  • 学会等名: 第27回日本Cell Death学会 学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 腸管上皮バリアにおける転写因子JunBの役割 (2018)
  • 著者名/発表者名: 片桐 翔治, 山﨑 創, 三上 哲夫, 遠藤 昌吾, 住本 英樹, 亀田 秀人, 中野 裕康
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] MIND BOMB-2はcFLIPLを安定化することにより細胞死を抑制する (2018)
  • 著者名/発表者名: 中林修, 高橋宏隆, 澤崎達也, 中野裕康
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] FRETバイオセンサーによるネクロプトーシス実行の１細胞イメージング (2018)
  • 著者名/発表者名: 村井 晋, 山口 良文, 白崎 義隆, 進藤 綾大, 中林 修, Hildebrand Joanne, 冨田 太一郎, 赤羽 悟美, Silke John, 三浦 正幸, 中野 裕康
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] 家族性大腸腺腫症モデルマウスにおけるインターロイキン-11産生細胞の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 竹田 若水, 仁科 隆史, 出口 裕, 西山 千春, 中野 裕康
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Blockade of TNFR1-dependent and -independent cell death is crucial for normal epidermal differentiation (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryosuke Miura, Xuehua Piao, Sanae Miyake, Sachiko Komazawa-Sakon, Chiharu Nishiyama, Hiroyasu Nakano.
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 国際学会
• [学会発表] A Novel FRET Biosensor for Necroptosis Uncovers Two Different Modes of the Release of DAMPs (2018)
  • 著者名/発表者名: Murai S, Nakano H
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 国際学会
• [学会発表] IL-11 is a novel marker of stromal fibroblasts that promote tumors in a murine model of colitis-associated cancer (2018)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nishina, Yutaka Deguchi, Wakami Takeda, Tetuo Mikami, Hiroyasu Nakano
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] A crucial role of JunB in attenuating epithelial damage-induced colitis through induction of regulatory T cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki S., Katagiri T., Sumimoto H., Nakano H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Blockade of TNFR1-dependent and -independent cell death is crucial for normal epidermal differentiation (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryosuke Miura, Chiharu Nishiyama, Hiroyasu Nakano.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [備考] 東邦大学医学部生化学講座
  • URL: http://tohobiochemi.jp/
• [備考] 東邦大学医学部研究グループが制御された細胞死「ネクロプトーシス」の可視化を世界で初めて実現
  • URL: https://research-er.jp/articles/view/74848
• [備考] 表皮細胞の環境変化が重篤な皮膚炎を引き起こすことを発見
  • URL: https://research-er.jp/articles/view/69260
• [産業財産権] 非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の検出方法 (2018)
  • 発明者名: 土屋勇一、中野裕康、永井英成、五十嵐良典
  • 権利者名: 土屋勇一、中野裕康、永井英成、五十嵐良典
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2018-245036