| 研究課題/領域番号 |
17K19566
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
金子 修 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (50325370)
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| 研究分担者 |
川合 覚 獨協医科大学, 医学部, 教授 (70275733)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| キーワード | マラリア / 赤血球侵入 / ワクチン / サル / 遺伝子改変 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度には、P. knowlesiにおいて薬剤により遺伝子発現を調節できる系の構築を進めたが、構築したプラスミドによる薬剤耐性原虫を得ることができず、新しいデザインを検討した。熱帯熱マラリア原虫では、ヒト免疫に最も暴露される感染赤血球表面に発現し、エピジェネティックに発現調節されているリガンド分子群について、このエピジェネティックな転写制御を担うSETvsと呼ばれる遺伝子座を破壊することで、強制的に転写抑制を解除し、全リガンド・レパートリーを感染赤血球表面に発現する形質を付与することができる。そこで、P. knowlesiにてSETvs相同体の相同組換えによるノックアウトを試みたが、組換え原虫を得ることができず、本遺伝子はP. knowlesiにとっては必須である可能性が出てきた。そのため、英国の研究機関にて確立されたCRISPR/Cas9を用いたP. knowlesiへの効率の良い遺伝子導入法を導入し、PkSETvsノックアウト用のプラスミド、PkSETvsの発現を薬剤により調節できる様に改変するプラスミド、および、PkSETvsにタグ配列を付与するプラスミドを作製し、P. knowlesiへ遺伝子導入した。その結果、タグ配列付与プラスミドでは薬剤耐性原虫を得ることができ、ゲノムへの挿入がPCRにより確認できたが、前２種のプラスミドでは薬剤耐性原虫を得ることができなかった。ゆえに、PkSETvsが必須である可能性がやはり高く、また、このノックダウン用プラスミドはデザインを変える必要があることが示唆された。一方、寄生赤血球表面に発現する分子の解析に向けて行った実験により、P. knowlesi寄生赤血球内の構造の一端が明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
P. knowlesiにおいて遺伝子発現を調節するためのプラスミドが挿入された組換え原虫を作製することができなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
P. knowlesiにおける遺伝子発現調節用プラスミドのデザインを再検討するとともに、他の遺伝子発現調節系を試みることで、原虫リガンドおよびPkSETvsの条件下ノックダウン原虫を作製する。赤血球表面に発現している抗原の転写抑制が解除されているか否か、また、抗原性が強化されているか否かを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子発現を調整する系による原虫を得ることができなかったため、当初予定していた条件下ノックダウンの影響評価を検討できなかった。発現調節用のプラスミドのデザインを変え、原虫リガンドおよびPkSETvsの条件下ノックダウン原虫を作製するためのプラスミド構築、原虫培養、原虫の遺伝子改変、タンパク質質発現解析等の分子細胞生物学解析を行うための試薬の購入に用いる。
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