| 研究課題/領域番号 |
17K19589
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
宮澤 恵二 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40209896)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | Smad / DNAアプタマー / 転写複合体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究はDNAアプタマーを用いて、Smad転写複合体のheterogeneityを検出する手法の確立を目指している。
30年度はネガティブ選択の過程を導入し、DNAアプタマーのスクリーニング手法の改良を行なった。まず、不活性型Smad複合体と相互作用する二本鎖DNA配列である3xCAGA配列と、TGF-β刺激した細胞の核抽出液を混合し、3xCAGA配列上に不活性型Smad複合体を結合させた。次いで、この不活性型Smad複合体を用いて、40ヌクレオチドのランダム配列をもつ一本鎖DNAライブラリーから吸収操作を行なった。この吸収操作により、3xCAGA配列上のSmad複合体と結合する一本鎖DNAを除去することができた。
プローブとして活性型Smad複合体を結合する二本鎖DNA配列である3xSBE配列、SmadとAP-1の複合体と結合するAP-1-m4配列、SmadとEts転写因子の複合体と結合するECS配列をビオチン化して用いた。吸収後のライブラリーからこれらのDNA配列に結合する活性型Smad複合体と共沈する一本鎖DNAアプタマーの濃縮を行なった。３～５サイクルの濃縮操作後、各々の段階で得られた結合DNAの配列を次世代シークエンサーで解析した。
3xSBEと結合するSmad複合体にはG-richな配列が結合していた。一方、AP-1-m4配列とECS配列に結合するSmad複合体と結合する配列にはG-richなものも見られたが、各々、特有の配列を含むDNA配列も結合することがわかった。濃縮度の高い配列についてビオチン化プローブを合成し、Smadタンパク質との結合実験を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
heterogenousな活性型Smad複合体に結合すると思われるDNAアプタマーの収集ができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
収集したDNAアプタマーをビオチン化したプローブを合成し、沈降実験を行うことにより。活性型Smad複合体のheterogeneityを検出する実験を進めていく。特にプローブの特異性に注目しながら、様々な条件下で調製した検体を用いて検討を深める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
メーカーのキャンペーン時に試薬を購入することにより、物品費を抑制できた。次年度の物品費として使用する予定である。
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