2018 年度実施状況報告書

免疫回避機構の網羅的探索

研究課題

研究課題/領域番号	17K19617
研究機関	産業医科大学
研究代表者	土井知光産業医科大学, 医学部, 講師 (70437218)
研究分担者	岩井佳子日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (90362467)
研究期間 (年度)	2017-06-30 – 2020-03-31
キーワード	免疫チェックポイント
研究実績の概要	がん細胞の免疫回避機構（免疫チェックポイント）は、がん免疫療法の最大の障壁である。したがって、がん治療を考える上で、免疫チェックポイントの理解は不可欠である。近年、がん免疫療法において、免疫チェックポイント分子であるPD-1及びPD-L1に対する中和抗体が、２０～３０％の患者で高い効果を示すことが示されている。一方で、残りの７０～８０％の患者では、効果が見られない。これはPD-1/PD-L1以外の免疫チェックポイント機構が関与していると考えられる。そこで本研究では、CRISPRゲノムワイドライブラリーを用いて、免疫回避機構を網羅的に探索することを目標としている。本年度は、前年度に作成したCRISPRゲノムワイドレンチウイルスライブラリーとB16メラノーマ担がんモデルを用いて、腫瘍の増殖に有利に働くCRISPR gRNAのスクリーニングを行なった。具体的には、CRISPRライブラリーを導入したB16細胞ライブラリーを作成し、マウスに腹腔内または皮下に移植し、増殖したB16細胞からgRNAの配列をPCRを用いて回収した。腹腔内移植したB16細胞の内、免疫から排除されずに生着した細胞は、腹腔内でコロニーを形成した。コロニーから回収したB16細胞のいくつかは、腫瘍形成能が親株より亢進しており、これらの細胞からいくつかの候補遺伝子が得られた。また皮下で形成した腫瘍からPCRで回収したgRNAを次世代シークエンサーで解析した結果、親ライブラリーと比較して濃縮された４１のgRNA配列を得ることが出来た。これらの中には自然免疫に関与する遺伝子も含まれていた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の計画通り、ライブラリーのスクリーニングを行い、候補遺伝子をいくつか同定することが出来た。
今後の研究の推進方策	本年得られた候補遺伝子に対するCRISPR gRNAをレンチウイルスベクターに個々にクローニングし、B16細胞に感染させ、候補遺伝子の欠損細胞株を作成する。これらの細胞におけるMHC class IIやPD-L1など免疫調節に関わる分子の発現を検討する。また、これらの細胞株をマウスに移植し、コントロールベクターを導入したB16細胞と比較して腫瘍能が亢進しているか確認し、これらの腫瘍における浸潤細胞をフローサイトメーター及び免疫組織染色を用いて解析を行う。また、候補遺伝子を過剰発現させた際の効果を検討することで、免疫回避機構の同定を行う。
次年度使用額が生じた理由	スクリーニングの回数が、当初予定より少なくなったため、次年度使用額が生じた。本年度も引き続き、次世代シークエンサーによりスクリーニング結果の解析を行い、当初予定通り、候補遺伝子を増やすために生じた次年度使用額を使用する予定である。得られた候補遺伝子は順次、個々に機能解析を行う。