iPSにより発生過程をトレースした難治性がん発癌モデル作成とマルチオミックス解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19623
• 研究機関: 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所)
• 研究代表者: 上條 岳彦 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 所長 (90262708)
• 研究分担者: 大平 美紀 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (20311384) ; 杉野 隆一 埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (90749516)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2019-03-31
• キーワード: 神経芽腫 / エピゲノム / 発がんモデル / iPS

研究実績の概要

これまでに正常人からのiPSをiPS研究所から3株、Li-Fraumeni症候群（LFS）の患者由来iPSをiPS研究所から１株入手し、iPSとしての培養保存、このiPSからNeural crest細胞(Neural Crest Cell: NCC)への分化はPlosOne; DOI:10.1371/journal.pone.0112291に基づき、マトリゲルコート培養皿にてFeeder Free mTeSR1培地2日＋CDM+SB+CHIR培地7日間で誘導し、p75high細胞をソーティングして、＞90％以上の陽性率を得た。これらのiPS/NCCペアのうち1ペアはトランスクリプトーム・メチローム・ChIPseqを行い解析中である。残り3ペアのトランスクリプトーム・メチローム・ChIPseqを実施中である。
iPSに対してMYCN遺伝子をトランスポゾンに導入し、誘導を行った。MYCN発現は確認できたが、悪性形質転換は得られなかった。そこで誘導したNCCに対してがん遺伝子MYCNを導入すると多数の悪性形質転換クローンを得ることができた。これらのクローンは足場非依存性増殖が可能であり、NCC細胞培養で必要であったフィブロネクチンに非依存になった。また、これらのクローンでのMYCN遺伝子高発現をRT-PCRおよびウェスタンブロッティングで確認した。これまで報告が無かった多能性幹細胞由来の正常細胞をMYCNで形質転換した神経芽腫モデルが得られたと考えられる。現在、p75レセプター、GD2、CD24,CD140b等の表面マーカー蛋白をFACS解析中である。また、免疫不全マウスにてXenograft形成を施行中である。これらのクローンのトランスクリプトーム・メチローム・ChIPseqを実施し、MYCNによる神経芽腫発がんのエピゲノム機構を明らかにしていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに正常人からのiPSをiPS研究所から3株、Li-Fraumeni症候群（LFS）の患者由来iPSをiPS研究所から１株入手し、iPSとしての培養保存、このiPSからNeural crest細胞の分化に成功した。マルチオミックス解析を2018年度に実施する。
大きな課題であった多能性幹細胞由来の正常細胞をMYCNで形質転換した神経芽腫モデルが得られたと考えられる。これによって発生過程を考量した神経芽腫発がん機構の解析が可能になり、これらの形質転換クローンのマルチオミックス解析が可能になった。

今後の研究の推進方策

iPS/NCCペアのうち残り3ペアのトランスクリプトーム・メチローム・ChIPseqを行い解析する。これらのマルチオミックス解析によって、神経芽腫発がん母地と考えられるNCC細胞分化のメカニズムについてエピゲノム機構を明らかにし、報告する方針である。
さらに神経芽腫モデルMYCN形質転換クローンを多数得ることができ、これらのクローンのトランスクリプトーム・メチローム・ChIPseqを実施し、MYCNによる神経芽腫発がんのエピゲノム機構を今年度明らかにしていく。

次年度使用額が生じた理由

マルチオミックス解析の一部を次年度増加することとしたため、必要な経費を繰り越したことによる。次年度に発現マイクロアレイ用品、メチロームアレイ用品、ChIPseq用品を発注するための物になる。

研究成果

• [雑誌論文] EZH2 regulates neuroblastoma cell differentiation via NTRK1 promoter epigenetic modifications (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhenghao Li, Hisanori Takenobu, Amallia Nuggetsiana Setyawati, Nobuhiro Akita, Masayuki Haruta, Shunpei Satoh, Yoshitaka Shinno, Koji Chikaraishi, Kyosuke Mukae, Jesmin Akter, Ryuichi P. Sugino, Atsuko Nakazawa, Akira Nakagawara, Hiroyuki Aburatani, Miki Ohira, Takehiko Kamijo
  • 雑誌名: ONCOGENE 巻: 37 ページ: 2714-2727
  • DOI: 10.1038/s41388-018-0133-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of the genetic and clinical characteristics of neuroblastomas using genome-wide analysis (2017)
  • 著者名/発表者名: Uryu Kumiko、Kamijo Takehiko、Takita Junko他
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 107513-107529
  • DOI: 10.18632/oncotarget.22495
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Neurocan, an extracellular chondroitin sulfate proteoglycan, stimulates neuroblastoma cells to promote malignant phenotypes (2017)
  • 著者名/発表者名: Su Zhendong、Kishida Satoshi、Tsubota Shoma、Sakamoto Kazuma、Cao Dongliang、Kiyonari Shinichi、Ohira Miki、Kamijo Takehiko、Narita Atsushi、Xu Yinyan、Takahashi Yoshiyuki、Kadomatsu Kenji
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 106296-106310
  • DOI: 10.18632/oncotarget.22435
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Genomic analysis–integrated whole-exome sequencing of neuroblastomas identifies genetic mutations in axon guidance pathway (2017)
  • 著者名/発表者名: Li Yuanyuan、Ohira Miki、Zhou Yong、Xiong Teng、Luo Wen、Yang Chao、Li Xiangchun、Gao Zhibo、Zhou Rui、Nakamura Yohko、Kamijo Takehiko、Kaneko Yasuhiko、Taketani Takeshi、Ueyama Junichi、Tajiri Tatsuro、Zhang Hongyan、Wang Jian、Yang Huanming、Yin Ye、Nakagawara Akira
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 56684-56697
  • DOI: 10.18632/oncotarget.18079
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] CFC1 is a cancer stemness-regulating factor in neuroblastoma (2017)
  • 著者名/発表者名: Chikaraishi Koji、Takenobu Hisanori、Sugino Ryuichi P.、Mukae Kyosuke、Akter Jesmin、Haruta Masayuki、Kurosumi Masafumi、Endo Takaho A.、Koseki Haruhiko、Shimojo Naoki、Ohira Miki、Kamijo Takehiko
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 45046-45059
  • DOI: 10.18632/oncotarget.18464
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cancer-type OATP1B3 mRNA has the potential to become a detection and prognostic biomarker for human colorectal cancer (2017)
  • 著者名/発表者名: Sun Yuchen、Harada Manami、Shimozato Osamu、Souda Hiroaki、Takiguchi Nobuhiro、Nabeya Yoshihiro、Kamijo Takehiko、Akita Hidetaka、Anzai Naohiko、Chiba Kan、Furihata Tomomi
  • 雑誌名: Biomarkers in Medicine 巻: 11 ページ: 629～639
  • DOI: 10.2217/bmm-2017-0098
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Effects of development regulators on neuroblastoma biology (2017)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Kamijo
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association