| 研究課題/領域番号 |
17K19628
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| 研究機関 | 愛知県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
関戸 好孝 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学分野, 副所長兼分野長 (00311712)
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| 研究分担者 |
佐藤 龍洋 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学分野, 主任研究員 (70547893)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 中皮細胞 / アノイキス / 上皮間葉転換 / 細胞特性 / 遺伝子発現 |
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| 研究実績の概要 |
当グループが樹立した不死化正常中皮細胞株 (HOMC株) 3株を用いて超低接着表面ディッシュにて3次元培養を行った。上皮型の形態を示すHOMC-B細胞株は、中間型および肉腫型の形態をしめす細胞株に比べアノイキスに極めて感受性であった。HOMC-B細胞株に転写コアクチベータであるYAP遺伝子を導入したところ、アノイキスに抵抗性を獲得することを確認し、YAPによって転写制御される遺伝子群の中にアノイキス抵抗性を賦与する遺伝子の存在が示唆された。正常中皮細胞に対してアノイキス抵抗性を賦与する遺伝子を同定するために、レンチウイルスgRNAライブラリーによるスクリーニングの準備を行った。Cas9遺伝子をHOMC-B細胞株に導入し、Cas9を安定的に発現するHOMC-B細胞株のサブクローニングを行った。ウエスタンブロット法によりサブクローン化したHOMC-B株数株で安定的にCas９を発現する細胞を同定した。さらにCas9の導入によりアノイキス抵抗性が変化しない細胞株を明らかにした。
上皮間葉転換(EMT)に関しては、運動能を亢進する活性型Rac1変異体(G12V)を導入し、HOMC-B細胞のmigration能の変化をボイデンチャンバー法で検討した。また、EMT抵抗性のモデル細胞として細胞遊走を阻害するRac1 negative mutant (T17N)を合わせて検討した。さらに、IL1-betaやTGF-betaなどのサイトカイン等を添加してその運動能を検討した。
HOMC細胞株3株から抽出したRNAを用いたマイクロアレイ解析のデータを用い、さらに情報解析を進めた。GSEA解析を行い、特徴的な遺伝子セットを明らかにした。HOMC-A株（肉腫型）がHOMC-B株（上皮型）に比べて極めて発現が高い遺伝子群のうち、上皮間葉転換（EMT）に係る遺伝子群について着目し検討を加えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
中皮細胞の特性を理解するために樹立した不死化正常中皮細胞株の核型、形態、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現パターンを解析するとともに、本年度はアノイキス抵抗性に対するアッセイ系の構築において研究の進展が見られた。超低接着表面ディッシュを用いた培養により上皮様細胞HOMC-B株がアノイキス感受性であることを予想通り確認することができ、同時にHOMC-B株にCas9遺伝子を導入し、安定的にCas9を発現する細胞株が複数樹立できたことから、中皮細胞にアノイキスに対する抵抗性を賦与する分子機構の解明に向けて、研究は概ね予定通り進んでいるといえる。
一方、中皮細胞の上皮間葉転換（EMT）易移行性の分子機構の解明と治療標的候補の同定に向けた研究においては、ボイデンチャンバーを用いた細胞遊走実験を用いて、条件を様々に変化させて検討したが、予想に反して本アッセイ系での再現性が得られにくかった。HOMC-B細胞株にRhoファミリー低分子量GTPaseであるRac1の恒常的活性型変異体を導入したり、IL-1beta、TGF-betaなどのサイトカイン、成長因子などの刺激を試したりして各種のアッセイを行ったが、migration能の変化に関する結果にバラツキがあり、HOMC細胞株のアノイキス抵抗性の研究が進んだことからも、一旦、中止し改めてアッセイ系を再構築することとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
中皮細胞は上皮細胞に比べ、上皮間葉転換（EMT）易移行性およびアノイキス抵抗性といった特徴的な細胞特性を有する。それらの細胞特性が中皮細胞が表面を覆う体腔（胸腔、腹腔）に発症する各種の腫瘍性病変、炎症性病変を惹起し、増悪させることが強く示唆されている。アノイキス抵抗性の分子機構の解析においては、正常不死化中皮細胞HOMC細胞株を用いた3D培養条件での検討を進め、細胞の生存・増殖・細胞死・細胞形態などについて解析を行い、現在までに上皮様形態を有するHOMC-B株においてアノイキス感受性が極めて高いことが明らかになった。今後は網羅的な遺伝子発現解析の結果を基にした解析や、スクリーニング解析を進め、中皮細胞に対してアノイキス抵抗性を賦与する因子の探索を進めていく。候補分子が同定された際にはRNA干渉法や阻害剤等の検討により、アノイキス抵抗性が影響を受ける分子・シグナル伝達系の解析を行う。
一方、EMT易移行性に関しては、現在までのアッセイ系を見直しより効率的で再現性を有するアッセイ系を探索していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は細胞のアッセイ系に関する様々な培養条件の調整等の予備実験を行ったため、予定していた本実験を行うことが少なく、そのため消耗品等の購入の必要がなかった、次年度、これらの使用は必須となる。
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