2017 年度実施状況報告書

組織線維化の非侵襲的診断法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	17K19650
研究機関	浜松医科大学
研究代表者	間賀田泰寛浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 教授 (20209399)
研究分担者	阪原晴海浜松医科大学, 医学部, 教授 (10187031) 鈴木千恵浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 助教 (20637285) 清水広介浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 准教授 (30423841)
研究期間 (年度)	2017-06-30 – 2020-03-31
キーワード	核医学 / 分子イメージング / 線維化 / PET / SPECT
研究実績の概要	平成29年度は、組織線維化のイメージング診断に向けた検出プローブの創出およびその評価を行うことを目的としていた。その検出プローブとしては、抗オステオポンチン抗体の使用を当初予定していたが、抗Tissue factor抗体へと変更した。抗Tissue factorモノクローナル抗体の入手に際し、抗体を産生するハイブリドーマから抗体を精製する方法については、Crlj:CD1-Foxn1nuマウス腹腔内におけるハイブリドーマの大量培養および、腹水からのアフィニティークロマトグラフィーを用いた方法を採用し、予備検討にて精製できることを確認した。また組織線維化モデルとしては、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）モデルを選択した。NASHモデルマウス作製にあたり、従来は簡便かつ短期間で作製が可能なメチオニン・コリン欠乏飼料（MCD飼料）摂食によるものが広く用いられてきたが、著しい体重減少が見られるためモデルとしての適合性を不安視し、体重減少を極力抑えたコリン欠乏、メチオニン減量高脂肪飼料（CDAHFD）を摂食させるモデルを採用することとした。摂食開始から肝組織の線維化が確認されるまでに従来法より時間を要するが、線維化の段階的評価が可能であるため適当であると言える。現在モデル作製に向け、準備を進めている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由線維化組織のイメージング診断に向けた検出プローブとして当初、線維化部位に多く発現するとされているオステオポンチンに対する抗体（抗オステオポンチン抗体）を使用する予定であったが、使用する抗体（モノクローナル抗体）の入手が困難となったため他の候補を選定することとなった。結果としては同じく組織線維化の初期に発現が見られ、外因性血液凝固の引き金となるタンパク質でもある組織因子（Tissue factor）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを入手できることとなったため、その手続きに時間を要し、当初の予定から多少遅れることとなった。ハイブリドーマから抗体を精製する方法は既に予備実験にて確立できているため、次年度は得られた抗体を用いて実際に動物モデルを用いて行なっていく予定である。またNASHモデルマウスの作製についても、当初予定していた飼料から変更があり、飼料の入手とモデル作製に時間を要した。しかしこちらも準備はできているため、次年度から直ぐに取りかかることで当初の目的まで達成できると考えている。
今後の研究の推進方策	平成30年度以降については、まず抗Tissue factorモノクローナル抗体の精製法を既に確立しているため、大量精製を試みる。一方、NASHモデルの肝組織におけるTissue factorの発現確認および線維化の組織染色を行い、インビボイメージングに向けた実験スケジュールを確定する。次に得られた抗体について蛍光標識を行い、NASHモデルにおける蛍光イメージングを行う。さらに抗体のγ線放出各種による放射標識を行い、SPECTを用いて非侵襲的なイメージング実験を行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	【次年度使用額が生じた理由】当初予定していたターゲット分子に変更が生じたため、抗体を産生するハイブリドーマの入手までに時間を要し、実験が当初の予定よりも遅れが生じた。またNASHモデルの選定および飼料入手に時間を要した。このため、物品購入が予定よりも少なくなった。しかし抗体の大量精製法の確立およびNASHモデル作製に向けた準備は既にできているため、次年度以降は支障なく順調に研究が進むと考えている。【使用計画】研究体制は既に整っているため、次年度にて使用額を費やし研究計画を元に実験を進めていく予定である。平成30年度は特にマウスを用いた検討がメインとなり、NASHモデルマウスにおける抗体の蛍光イメージングを行い、肝組織線維化イメージングの可能性を探るとともに、非侵襲的なSPECT診断法確立に向けた検討を行う予定である。