希少遺伝性疾患治療薬開発基盤技術創出

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19665
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 山下 暁朗 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (20405020)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2019-03-31
• キーワード: NMD / 薬剤スクリーニングシステム / 嚢胞性線維症 / モデルマウス

研究実績の概要

本研究開発提案では、独自に樹立した高感度・高精度のmRNA 監視機構（Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)）評価システムの改良を行い、新規化合物のスクリーニング・バリデーションを行う。同時に、得られたリード化合物による希少遺伝性疾患治療のin vitro レベルでのPOC(概念実証)を取得し、開発を加速させる。
平成30年度は１）平成29年度に作成した、HiBit(Split-NanoLucペプチド)にいくつかのアミノ酸コドンを含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたレポーター（Hibit-mT4L-wt/PTC）を用い、様々な細胞ストレス依存的なNMD活性の変化を解析した。その結果、これまで、ストレス依存的翻訳抑制によりNMDが抑制されていると考えられていたストレスにおいて、翻訳抑制非依存的にNMDが抑制されるということを発見した。また、Hibit systemにはDual luciferase kit が市販されていないが、プロトコールの改良により、これを可能とした。
２）NMD抑制による遺伝性疾患治療モデルとして、ColVIにナンセンス変異を有するUllrich 病患者由来細胞をHPV-E7/TERT高発現により不死化し、蛍光染色法により新規SMG1阻害剤依存的な変異ColVIタンパク質蓄積を証明した。さらに、動物モデルとして、嚢胞性線維症原因遺伝子であるmCFTRの変異のうち、ヒトで5番目に多い変異であるCFTR-W1282Xに相当するmCFTR-W1278X ノックインマウスをCRISPR-CAS9 systemにより作成した。mCFTR-W1278Xマウスは、mCFTRノックアウトマウスと同様、生後6~9週での致死であることが観察されたが、これについて、凍結受精卵の作成を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Effects of rikkunshito on renal fibrosis and inflammation in angiotensin II-infused mice (2019)
  • 著者名/発表者名: Azushima Kengo、Uneda Kazushi、Wakui Hiromichi、Ohki Kohji、Haruhara Kotaro、Kobayashi Ryu、Haku Sona、Kinguchi Sho、Yamaji Takahiro、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Tamura Kouichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 6201
  • DOI: 10.1038/s41598-019-42657-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of ATRAP in Renal Proximal Tubules on Angiotensin‐Dependent Hypertension (2019)
  • 著者名/発表者名: Kinguchi Sho、Wakui Hiromichi、Azushima Kengo、Haruhara Kotaro、Koguchi Tomoyuki、Ohki Kohji、Uneda Kazushi、Matsuda Miyuki、Haku Sona、Yamaji Takahiro、Yamada Takayuki、Kobayashi Ryu、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Fujikawa Tetsuya、Tamura Kouichi
  • 雑誌名: Journal of the American Heart Association 巻: 8 ページ: e012395
  • DOI: 10.1161/JAHA.119.012395
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Environmental stresses suppress nonsense-mediated mRNA decay (NMD) and affect cells by stabilizing NMD-targeted gene expression (2019)
  • 著者名/発表者名: Usuki Fusako、Yamashita Akio、Fujimura Masatake
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 1279
  • DOI: 10.1038/s41598-018-38015-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Early Enhanced Leucine-Rich α-2-Glycoprotein-1 Expression in Glomerular Endothelial Cells of Type 2 Diabetic Nephropathy Model Mice (2018)
  • 著者名/発表者名: haku Sona、Wakui Hiromichi、Azushima Kengo、Haruhara Kotaro、Kinguchi Sho、Ohki Kohji、Uneda Kazushi、Kobayashi Ryu、Matsuda Miyuki、Yamaji Takahiro、Yamada Takayuki、Minegishi Shintaro、Ishigami Tomoaki、Yamashita Akio、Ohashi Kenichi、Tamura Kouichi
  • 雑誌名: BioMed Research International 巻: 2018 ページ: 1～9
  • DOI: 10.1155/2018/2817045
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1によるアミノ酸飢餓応答依存的遺伝子発現制御 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山下 暁朗
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] PI3 kinase様タンパク質リン酸化酵素SMG1による酸化ストレス応答制御：SMG1によるNRF2活性制御機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤川 由美子, 山下 暁朗, 大貫 哲男, 鈴木 香絵, 青柳 杏子, 黒澤 瞳, 廣瀬 博子, 永井 陽子, 上村 博司, 吉田 稔, 髙橋 秀尚, 大野 茂男
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] SMG1によるNMDとストレス応答統御機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山下 暁朗
  • 学会等名: 第7回さきがけ「RNAと生体機能」研究会
• [学会発表] PI3-kinase related kinase SMG1 and DNA-PKcs directly phosphorylate and regulate NRF2 in response to oxidative stress. (2018)
  • 著者名/発表者名: 山下 暁朗
  • 学会等名: 京都大タンパク質動態研究所・新学術領域「新生鎖の生物学」合同国際シンポジウム Proteins : from the Cradle to the Grave