母体低栄養と胎仔視床下部GABA-Clシステム変調による脳の発達障害機序の解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19682
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2019-03-31
• キーワード: 発達障害 / 低栄養 / 胎児脳 / ストレス / 視床下部

研究実績の概要

1．母体低栄養胎仔における既知・新規HPA軸反応標識系の確立：AgRP-mCitrineマウスとCRH-GCaMP3マウスを交配し、AgRP細胞選択的にmCitrineを、CRH細胞選択的にGCaMP3を発現するマウス（AgRP-mCitrine/CRH-GCaMP3）を作製した。成獣の摂餌制限を行い、弓状核のAgRP細胞（mCitrine）と室傍核のCRH細胞（GCaMP3）でc-fosの発現が上昇していることを免疫組織化学法で確認した。また、室傍核スライス標本を作製し、CRH細胞からグラミシジンパッチクランプやCa2+測定ができることを確認した。
２．遺伝子改変マウスへの母体低栄養負荷モデルの作製：WNKによるKCC2リン酸化部位変異導入（疑似持続リン酸化）マウス(KCC2 T906E-T1007E)の継代繁殖に成功した。AgRP細胞選択的にGABA合成を欠失したマウス（AgRPCre/+-mCitrine/GAD67flox/flox）を作製するための、GAD67flox/floxマウスを入手し、繁殖に取り掛かった。母体低栄養モデルでは摂餌制限（-30%）を妊娠10.5-18.5日に行い、胎生期低栄養マウスモデルを作成した。野生型でも出生体重が有意に低下することを確認した。モデルマウス胎仔でAgRP細胞（mCitrine）、CRH細胞（GCaMP）の胎生期での発生を確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

既知・新規HPA軸反応標識系の確立はAgRP-mCitrineマウスとCRH-GCaMP3マウスを交配し、AgRP細胞選択的にmCitrineを、CRH細胞選択的にGCaMPを発現するマウスを作出し、交付申請書に記載した「研究の目的」どおりに達成した。しかし、母体低栄養モデルでは、まずは非妊娠成獣での既知・新規HPA軸の低栄養への反応の確認を先行させたので、妊娠個体への負荷は次年度行う。母体低栄養／胎仔視床下部GABA-Clシステム変調モデルの準備として、KCC2 T906E-T1007Eマウスを確立し、胎生期低栄養マウスモデルの作製にも着手しているので、全体としては、おおむね順調に進展していると自己評価した。

今後の研究の推進方策

１．遺伝子改変マウス胎仔脳の神経細胞の発生・移動の解析：AgRP-mCitrine/CRH-GCaMP3マウス胎仔でのc-fos発現を野生型と比較し、母体低栄養が胎仔GABAシステムを介して新規HPA軸と既知HPA軸に与える影響を確認する。AgRP-mCitrineマウス、CRH-GCaMP3マウスとVGAT-tdTomato tgマウスホモを交配し、Alexa-EdUによる細胞分裂アッセイを用い、脳室帯での皮質板細胞の発生（Alexa）、内側線条体原基でのGABA細胞の発生（Alexa/tdTomato）、第三脳室周辺でのAgRP細胞（Alexa/mCitrine）、CRH細胞（Alexa/GCaMP）の発生と続いて起こるこれらの細胞の移動を、GABAA受容体、グルココルチコイド受容体、CRH受容体との共存と移動の過程も含め評価する。
２．母体低栄養／胎仔視床下部GABA-Clシステム変調モデルの解析：母体の低栄養の有無と仔のGAD67遺伝子ヘテロ欠損の有無の4群で脳組織を回収し、RRBS法で、次世代シーケンサー（成育医療センター）を用いて網羅的DNAメチル化解析を行う。モデルの出生後は里親に飼育させ、生後8週齢で社会的行動、認知機能、衝動性・注意機能、感覚運動系機能などの行動解析による評価を行う。また、脳波を記録してγ帯成分をパワースペクトラムで解析する。さらに評価終了後に屠殺し、１．で確認した影響の成長後を、視床下部、内側前頭皮質、大脳新皮質、海馬・扁桃体などの辺縁皮質で確認する。以上から、精神疾患病態フェノタイプとの整合性を評価する。

次年度使用額が生じた理由

計画では物品費￥1,750,000・旅費￥350,000・その他￥200,000を計上し、成果発表と研究打合せにそれぞれ旅費がかかることを想定していたが、学会での成果発表の際に併せて研究打合せも行ったため、当初予定額よりも旅費が抑えられた。次年度使用額については、主に消耗品費や旅費として利用する。また、現在実験に使用している現有備品が老朽化しており、もしも不具合が生じて実験の遂行に支障が生じた場合は、その修理もしくは代替品の購入に要する費用の一部とする。

研究成果

• [国際共同研究] Yale School of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Yale School of Medicine
• [国際共同研究] マインツ大学(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: マインツ大学
• [雑誌論文] MHC class I in dopaminergic neurons suppresses relapse to reward seeking (2018)
  • 著者名/発表者名: Murakami G, Edamura M, Furukawa T, Kawasaki H, Kosugi I, Fukuda A, Iwashita T, Nakahara D.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 4:eaap7388 ページ: -
  • DOI: 10.1126/sciadv.aap7388
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Optical measurement of glutamate in slice preparations of the mouse retina (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohkuma M, Kaneda M, Yoshida S, Fukuda A, Miyachi E.
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: In press ページ: In press
  • DOI: 10.1016/j.neures.2018.03.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Biallelic Variants in CNPY3 , Encoding an Endoplasmic Reticulum Chaperone, Cause Early-Onset Epileptic Encephalopathy (2018)
  • 著者名/発表者名: Mutoh H, Kato M, Akita T, Shibata T, Wakamoto H, Ikeda H, Kitaura H, Aoto K, Nakashima M, Wang T, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Kakita A, Miyake K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 雑誌名: The American Journal of Human Genetics 巻: 102 ページ: 321-329
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2018.01.004
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] De novo variants in CAMK2A and CAMK2B cause neurodevelopmental disorders (2018)
  • 著者名/発表者名: Akita T, Aoto K, Kato M, Shiina M, Mutoh H, Nakashima M, Kuki I, Okazaki S, Magara S, Shiihara T, Yokochi K, Aiba K, Tohyama J, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Ogata K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 雑誌名: Annals of Clinical and Translational Neurology 巻: 5 ページ: 280-296
  • DOI: 10.1002/acn3.528
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Taurine as an Essential Neuromodulator during Perinatal Cortical Development (2017)
  • 著者名/発表者名: Kilb W, Fukuda A.
  • 雑誌名: Frontiers in Cellular Neuroscience 巻: 11:328 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fncel.2017.00328
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] De novo CaMKⅡα/β mutants causing neurodevelopmental disorders upregulate A-type voltage-dependent K+ currents in hippocampal neurons. (2018)
  • 著者名/発表者名: Akita T, Aoto K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] WNK3 kinase regulates inwardly rectifying potassium current in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya S, Hosoi Y, Sohara E, Mutoh H, Akita T, Uchida S, Fukuda A.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] Temporally genetic expression of KCC2 in GnRH neurons in vivo causes impairment of fertility. (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Nabekura J, Fukuda A.
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] タウリン欠乏はGABAA受容体のリン酸化状態を変化させることにより大脳皮質感覚野錐体細胞におけるポストシナプスのGABAA受容体数を減少させる. (2018)
  • 著者名/発表者名: 細井泰志, 渡部美穂, 秋田天平, 武藤弘樹, 伊藤崇志, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第4回国際タウリン研究会日本部会
• [学会発表] The role of GABAergic interneuron-astrocyte interaction in epileptic seizures. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, H., Fukuda, A.
  • 学会等名: 第１回山梨大学先端脳科学特別教育プログラム国際シンポジウム
  • 国際学会
• [学会発表] GABA synaptic dynamics and astrocytic Cl- buffering underlying neural network oscillation. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫
  • 学会等名: 第47回日本臨床神経生理学会学術大会
• [学会発表] A novel CRH secretory mechanism by an excitatory GABAergic input from the arcuate nucleus to the median eminence. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: The 17th Hamamatsu-Kyungpook Joint Medical Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S., Fukuda, A.
  • 学会等名: The 17th Hamamatsu-Kyungpook Joint Medical Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes perturbs GABAergic neurogenesis, GABAergic synapse formation and behavioral phenotypes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A. Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T. and Hata, K.
  • 学会等名: Neuroscience 2017
  • 国際学会
• [学会発表] Constitutive phosphomimetic inhibition of KCC2 at Thr906/Thr1007 causes GABA-dependent network excitability, seizure, and early postnatal death. (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, M., Duan, J., Mansuri, M., Zhang, J., Fukuda, A. and Kahle, K.T.
  • 学会等名: Neuroscience 2017
  • 国際学会
• [学会発表] KCC2 dysfunction underlying infantile and neonatal seizures in an animal model. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫, 渡部美穂, 秋田天平, Kahle, K.
  • 学会等名: 第51回日本てんかん学会学術集会
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1- heterozygotes affects inhibitory synaptic transmission. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang, T., Sinha Adya, S., Akita, T., Yanagawa, Y., Fukuda, A.
  • 学会等名: 生理学研究所研究会「シナプス・神経回路機能の時空間制御」
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes perturbs development of brain and behavior by epigenetic mechanism. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang T, Sinha AS, Yanagawa Y, Kawai T, Hata K and Fukuda A.
  • 学会等名: 第44回日本脳科学会
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] 生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロン制御における興奮性GABA入力の役割. (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡部美穂, 鍋倉淳一, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] てんかん原性獲得過程における抑制性神経とグリア細胞の相互作用. (2017)
  • 著者名/発表者名: 武藤弘樹, 福田敦夫
  • 学会等名: 第64回中部日本生理学会
• [学会発表] A novel CRH secretory mechanism by GABAergic input from the arcuate nucleus to the axon terminals of high [Cl-]i. (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: Seminar of Center for Neuron-Glia Interaction, KIST(Korea Institute of Science and Technology)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Taurine depletion reduces postsynaptic GABAA receptors in layer 2/3 pyramidal neurons of the somatosensory cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hosoi, Y., Akita, T., Watanabe, M., Mutoh, H., Miyajima, H. and Fukuda, A.
  • 学会等名: XXIII World Congress of Neurology（WCN2017）
  • 国際学会
• [学会発表] 母体ストレスとGABAが仔脳発達に与える病態生理学的影響. (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫, 王天英, Sinha Adya S, 柳川右千夫, 河合智子, 秦健一郎.
  • 学会等名: 第27回日本病態生理学会大会
• [学会発表] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sinha Adya, S., Hosoi,Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会
• [学会発表] The role of GABAergic interneuron-astrocyte interaction in epileptic seizures. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, H., Fukuda, A.
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会
• [学会発表] Cellular Mechanisms Underlying Status Epilepticus: what do animal models tell us? (2017)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, A.
  • 学会等名: The 19th Annual Meeting of Infantile Seizure Society International Symposium on Status Epilepticus in Infants and Children
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes selectively perturbs parvalbumin (PV)-positive GABAergic neurogenesis, GABA synapses and social interaction behavior. (2017)
  • 著者名/発表者名: Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T., Hata, K. and Fukuda, A.
  • 学会等名: IBNS 26th Annual Meeting
  • 国際学会
• [備考] 浜松医科大学医学部神経生理学講座ホームページ
  • URL: http://www.hama-med.ac.jp/uni_education_igakubu_igaku_seiri1.html