視細胞変性疾患における網膜電図（ERG）の新しい概念確立に関する研究

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K19721
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 近藤 峰生 三重大学, 医学系研究科, 教授 (80303642)
• 研究分担者: 杉本 昌彦 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (00422874) ; 生杉 謙吾 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (10335135) ; 松原 央 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (20378409)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2020-03-31
• キーワード: 動物モデル / 網膜電図 / 網膜色素変性 / a波 / ウサギ

研究実績の概要

1933年にERGの起源がGranitの動物実験によって示されてから、ERGの最初の陰性波であるa波の起源は視細胞であると長く信じられてきており、その後のシナプス遮断薬を用いた動物実験（Robson et al. J Physiol 2003; Robson et al. Prog Retin Eye Res 2014）でもこれは証明されている。そのため、現在でも世界の多くの視覚科学者は哺乳類のERGのa波の起源はほとんどすべて視細胞であり、この原則は網膜に疾患がある状態であっても適応できる法則であると信じられている。しかし申請者は、これが病気の網膜では当てはまらず、特に進行した視細胞変性を有する網膜では、その起源のほとんどがアマクリン細胞あるいは神経節細胞といった3次ニューロンであるという推測を得てきた。それは、我々の作成したトランスジェニックウサギ（Tgウサギ）の2-3年後のERGの結果（Kominami et al. IOVS 2016）でも、また我々の遊離変性網膜の薬理学的実験（Fujii et al. Sci Rep 2016）からも推測されてきている。これを証明するため、2018年度は正常なウサギの錐体ERGの細胞起源を明らかにした。まずはTTXとNMDAで3次ニューロンを遮断し、次いでCNQXを使ってOFF型双極細胞を遮断して錐体ERGを記録した。この結果により、正常なウサギの錐体ERGのa波に関しては、比較的弱い光刺激に対してはOFF型双極細胞が主な起源であり、残りは錐体視細胞が起源であった。しかしながら刺激の強度が増した状態ではa波全体における錐体視細胞の関与の割合が大きくなり、OFF型双極細胞の割合は相対的に低下することがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでの研究成果により、ウサギの錐体a波を記録して薬理学的操作を行う研究環境は整い、網膜機能が正常なウサギにおける錐体a波の起源についても確認できた。これについては、以前の我々の研究成果から推測できる結果とほぼ同等であった（Hirota et al. IOVS 2012）。以前の2012年の結果では、視細胞が変性したトランスジェニックウサギ（Tgウサギ）の錐体a波の成分の起源は、正常ウサギと同様に錐体視細胞とOFF型双極細胞であり、割合としてはOFF型双極細胞の関与が正常より大きいことが判明していた。しかし2012年の予備実験で使用したウサギは変性が初期の軽度の視細胞変性ウサギばかりであった。これまで視細胞の変性が非常に進んだ状態の錐体ERGのa波起源は全く調べられておらず、本年度（2019年度）は、最終段階としてこの点を明らかにしていく。Tgウサギの飼育と管理を委託している北山ラベス（株）から年長のTgウサギを三重大学に搬入し、TTX+NMDA, CNQXを作用して細胞の遮断を行いながら、高度に視細胞の変性が進んだTgウサギの錐体ERGのa波の起源を明らかにする。

今後の研究の推進方策

本年度は、本研究の最も重要な核心的研究を行う。視細胞の変性が非常に進行したトランスジェニックウサギ（Tgウサギ）に対して、ERGをtetrodotoxin (TTX)とN-methyl-D-aspartic acid (NMDA)を作用させた前後に記録する。TTXとNMDAを同時に硝子体内に注射すると網膜の3次ニューロン（アマクリン細胞および網膜神経節細胞）はほぼ完全に遮断される。TTX＋NMDAを作用させたあとに、進行した変性TgウサギのERGのa波がどの程度低下するかをa-wave fittingで計算し、もしこの段階で高度な加算平均を行ってもa波が検出できない程度に減弱していれば、進行した視細胞変性の網膜から記録したERGのa波は全て3次ニューロンであることになる。もしもTTX＋NMDAを注射後に記録したERGにa波がわずかでも残存していた場合には、続いてAMPA/KA型受容体のantagonistである6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione disodium salt hydrate (CNQX)を作用させる。CNQXは錐体視細胞から錐体OFF型双極細胞への神経伝達活動を遮断することから、注射前後の波形の変化を観察することによってa波に占める錐体OFF型双極細胞の関与の割合を知ることができる。もしもこの段階で初めてa波が消失していれば、進行した視細胞変性の網膜から記録したERGのa波は2次ニューロンと3次ニューロンの混合由来であることになる。もしもTTX＋NMDAに続いてCNQXを注射してもERGのa波が残存していれば、これがa波における真の錐体視細胞起源の成分であり、これがbaselineのa波振幅の何％であるかをa-wave fittingを用いて算出する。

次年度使用額が生じた理由

今回の実験では、視細胞の変性が十分に進行した生後１年から２年の高齢のウサギを用いて詳細な電気生理学的実験を行う。我々が作成した視細胞変性ウサギは、平成31年度（2019年度）にやっと２年近くになる。そのため、2019年度に多くのウサギを購入する必要があるため、次年度に予算を確保しておく必要があった。このような2019年度の多額の動物購入費用を考慮して、今回の次年度使用額が生じることになった。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical preferences and trends of anti-vascular endothelial growth factor treatments for diabetic macular edema in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Sugimoto M, Tsukitome H, Okamoto F, Oshika T, Ueda T, Niki M, Mitamura Y, Ishikawa H, Gomi F, Kitano S, Noma H, Shimura M, Sonoda S, Sawada O, Ohji M, Harimoto K, Takeuchi M, Takamura Y, Kondo M, Sakamoto T
  • 雑誌名: J Diabetes Investig 巻: 3 ページ: 475-483
  • DOI: 10.1111/jdi.12929
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] CLINICAL COURSE OF PARANEOPLASTIC RETINOPATHY WITH ANTI-TRPM1 AUTOANTIBODY IN JAPANESE COHORT (2019)
  • 著者名/発表者名: Ueno S, Inooka D, Nakanishi A, Okado S, Yasuda S, Kominami T, Sayo A, Morimoto T, Kondo M, Katagiri S, Hayashi T, Terasaki H
  • 雑誌名: Retina 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1097/IAE.0000000000002329
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] New clinical ultrahigh-resolution SD-OCT using A-scan matching algorithm (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsui Y, Kondo M, Uchiyama E, Mityata R, Matsubara H
  • 雑誌名: Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 巻: 257 ページ: 255-263
  • DOI: 10.1007/s00417-018-4183-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Scleral buckling versus vitrectomy for young japanese patients with rhegmatogenous retinal detachment in the era of microincision surgery: real-world evidence from a multicentre study in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Shu I, Ishikawa H, Nishikawa H, Morikawa S, Okamoto F, Sakamoto T, Sugimoto M, Kondo M, Iwasaki M, Kinoshita T, Toibana T, Mitamura Y, Takamura Y, Motohashi R, Shimura M, Sakurai Y, Takeuchi M, Gomi F
  • 雑誌名: Acta Ophthalmol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/aos.14050
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Novel mutations in the RS1 gene in Japanese patients with X-linked congenital retinoschisis (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondo H, Oku K, Katagiri S, Hayashi T, Nakano T, Iwata A, Kuniyoshi K, Kusaka S, Hiyoshi A, Uchio E, Kondo M, Oishi N, Kameya S, Mizota A, Naoi N, Ueno S, Terasaki H, Morimoto T, Iwaki M, Yoshitake K, Iejima D, Fujinami K, Tsunoda K, Shinoda K, Iwata T
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: 6 ページ: 3
  • DOI: doi: 10.1038/s41439-018-0034-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Association between Retinal Nerve Fiber Layer Thickness and Eye Fatigue (2019)
  • 著者名/発表者名: Ayaki M, Kuze M, Kondo M, Tsubota K, Negishi K
  • 雑誌名: Biomed Res Int 巻: 2019 ページ: 3014567
  • DOI: 10.1155/2019/3014567
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Central serous chorioretinopathy with and without steroids: A multicenter survey (2019)
  • 著者名/発表者名: Araki T, Ishikawa H, Iwahashi C, Niki M, Mitamura Y, Sugimoto M, Kondo M, Kinoshita T, Nishi T, Ueda T, Kato A, Yasukawa T, Takamura Y, Gomi F
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 14 ページ: e0213110
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0213110
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] ISCEV extended protocol for the stimulus-response series for light-adapted full-field ERG (2019)
  • 著者名/発表者名: McCulloch DL, Kondo M, Hamilton R, Lachapelle P, Messias AMV, Robson AG, Ueno S
  • 雑誌名: Doc Ophthalmol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s10633-019-09685-8
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Genotype determination of the OPN1LW/OPN1MW genes: novel disease-causing mechanisms in Japanese patients with blue cone monochromacy (2018)
  • 著者名/発表者名: Katagiri S, Iwasa M, Hayashi T, Hosono K, Yamashita T, Kuniyoshi K, Ueno S, Kondo M, Ueyama H, Ogita H, Shichida Y, Inagaki H, Kurahashi H, Kondo H, Ohji M, Hotta Y, Nakano T
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 8 ページ: 11507
  • DOI: 10.1038/s41598-018-29891-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A Case of Focal Choroidal Excavation Development Associated with Multiple Evanescent White Dot Syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsubara H, Uchiyama E, Suzuki K, Matsuda Y, Kondo M
  • 雑誌名: Case Rep Ophthalmol 巻: 9 ページ: 388-394
  • DOI: 10.1159/000492747
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Supernormal Flicker ERGs in Eyes With Central Retinal Vein Occlusion: Clinical Characteristics, Prognosis, and Effects of Anti-VEGF Agent (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyata R, Kondo M, Kato K, Sugimoto M, Matsubara H, Ikesugi K, Ueno S, Yasuda S, Terasaki H
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci 巻: 59 ページ: 5854-5861
  • DOI: 10.1167/iovs.18-25087
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 2.Screening for diabetic retinopathy using mydriasis-free full-field flicker ERG device (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: Macula Society
  • 国際学会
• [学会発表] Clinical application of multifocal ERG (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: The 50th Annual Symposium of the International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)
  • 国際学会
• [学会発表] 3.Supernormal flicker ERGs in eyes with central retinal vein occlusion: Clinical characteristics, prognosis, and effects of anti-VEGF agent (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: The 11th Joint Meeting of Japan-Korea-China Ophthalmologists
  • 国際学会