| 研究課題/領域番号 |
17K19744
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
高戸 毅 東京大学, 医学部附属病院, 登録診療員 (90171454)
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| 研究分担者 |
大庭 伸介 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (20466733)
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (30344451)
北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (80788422)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 骨再生 / バイオインフォマティクス / 細胞遊走 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、先行研究において既に保有していた、骨格系細胞におけるH3K4-2メチル化部位やH3K27-アセチル化部位に関するエピゲノムデータを用いて、前年度同定した骨芽細胞前駆細胞遊走・補充促進候補遺伝子の転写制御領域の同定を検討した。候補遺伝子の周囲100 kbにわたって、上記エピゲノムマーカーの分布を指標に、骨芽細胞前駆細胞遊走・補充促進候補遺伝子の転写活性化に関わるエンハンサー候補領域を検索した。得られた候補領域に対して、そのDNA領域とルシフェラーゼ遺伝子を有するレポータ遺伝子を合成し、骨格系細胞に導入した。未分化骨芽細胞、分化誘導した骨芽細胞に加えて、比較対象として線維芽細胞を用いて検討した。また、同定したエンハンサー候補領域のin vivo骨形成に対する効果を検証するため、エンハンサーノックアウトマウスの作製に着手した。候補エンハンサーの両端にガイドRNAを設計し、CRISPR/Cas9の手法を用いて、ノックアウトマウスの作出を試みた。
次に、候補遺伝子の転写を誘導する低分子化合物を同定するため、候補となった転写制御領域と緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するレポータ細胞を作製した。レポータ細胞を96wellプレートに播種し、骨芽細胞分化誘導培地で異なる日数培養した細胞を用いて、GFP発現を観察することで、有望な低分子化合物の同定を目指した。化合物の毒性により細胞が死滅した場合は、化合物濃度を10分の1に希釈し同様の実験を行うこととした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
骨芽細胞前駆細胞遊走・補充促進遺伝子候補とその転写制御領域を同定した。また、そのレポータ細胞を用いた化合物スクリーニングを開始した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度作製に着手したエンハンサーノックアウトマウスの解析は、マウスの繁殖がスムーズに進めば今年度中に解析可能である。また、化合物スクリーニングにより有望な化合物が得られた場合、疾患モデルにおける治療効果の検討を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
保有している在庫物品を利用することができたため。来年度以降に関しては新たに購入が必要の見通し。
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