| 研究課題/領域番号 |
17K19744
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
高戸 毅 東京大学, 医学部附属病院, 名誉教授 (90171454)
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| 研究分担者 |
大庭 伸介 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (20466733)
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (30344451)
北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80788422)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 骨再生 / 細胞遊走 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、同定した骨芽細胞前駆細胞遊走・補充促進候補遺伝子の機能の検証を行った。候補遺伝子の機能検証のため、Crispr/Cas9システムを用いた機能喪失実験を行った。まず、標的遺伝子の第一エクソン部を標的としたガイドRNA(gRNA)を設計し、gRNA配列をレンチウイルスベクターに組み込んだ。次に、以前樹立したCas9恒常的発現型の骨芽細胞株に、レンチウイルスシステムを用いてgRNAを導入した。薬剤セレクションおよびジェノタイピングにより、標的遺伝子欠損細胞株を作製した。標的遺伝子欠損の確認のため、サンガーシークエンスおよびリアルタイムqPCR法を用いて、ゲノム配列の欠損と、mRNAの発現減少を確認した。現在、作成した候補遺伝子欠損細胞を用いて、2D Gap Closureアッセイ法およびBoyden Chamberアッセイ法を用いた、候補遺伝子欠損に対する細胞遊走性への関与を検討している。
また、候補遺伝子の転写を誘導する低分子化合物を同定するため、前年度作製したレポータ細胞を用いた薬剤スクリーニングを行った。しかしながら、得られた結果のばらつきが大きく、有望な薬剤を同定するには至らなかった。ばらつきの原因として、用いた細胞の不均一性が考えられたため、レポータ細胞をクローニングすることで、単一クローン由来の細胞株の樹立を試みた。化合物の毒性により細胞が死滅した場合は、化合物濃度を10分の1に希釈し同様の実験を行うことで、薬効を有する薬剤のスクリーニングを行った。これまでの結果、複数の候補化合物が見いだされた。
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