| 研究課題/領域番号 |
17K19750
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
村上 伸也 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (70239490)
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| 研究分担者 |
竹立 匡秀 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (60452447)
岩山 智明 大阪大学, 歯学研究科, 特任助教(常勤) (80757865)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| キーワード | 骨芽細胞 / 誘電率顕微鏡 / 基質小胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、溶液中に存在する生体試料を、常温常圧下においてナノレベルで観察することができる高分解能誘電率顕微鏡を用いて、骨芽細胞分化過程の詳細を可視化し、その全容を理解することを目的としている。本年度は主に以下の3つの成果を得た。
1.マウス骨髄間質細胞であるKUSA-A1細胞を用いて、同細胞が高分解能誘電率顕微鏡観察に必要な窒化シリコン薄膜上で培養可能であること、石灰化誘導用培地（βグリセロリン酸およびアスコルビン酸含有α-MEM）を用いた骨芽細胞への分化誘導が可能であることを確認した。さらに誘電率顕微鏡観察を行い、細胞内小器官の高コントラスト撮影を実現した。
2.KUSA-A1細胞を分化誘導培地で培養し、誘電率顕微鏡観察を行ったところ、誘導群においてのみ、粒子の形成が観察された。微細元素分析およびラマン分光イメージングにより、この粒子を詳細に解析したところ、リン酸とカルシウムを多く含み、ハイドロキシアパタイトに特有な960cｍ-1のラマンシフトを有することが明らかとなり、この粒子は石灰化過程において中心的な役割を果たす基質小胞であると考えられた。
3.骨芽細胞分化過程における基質小胞の形成・分泌過程の分子機構を解明するため、既知の石灰化関連遺伝子について、ゲノム編集技術を用いたノックアウト細胞クローンを作製した。中でもAlpl遺伝子のノックアウト細胞では上記で観察された基質小胞は全く観察されず、基質小胞形成に必須の遺伝子であることが示唆された。
以上の得られた結果を取りまとめ、国内の研究会で発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
予定していた窒化シリコン薄膜上での培養条件の最適化、高コントラスト観察が可能な撮影条件の検討が完了し、骨芽細胞分化過程の形状構造観察に成功した。さらに次年度に予定していた微細元素分析およびラマン分光イメージングを誘電率顕微鏡観察に組み合わせた分析、CRISPR/Cas9を用いたノックアウト細胞クローンの樹立までが本年度中に遂行されたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、研究分担者・研究協力者との打ち合わせを綿密に行いながら、本年度に確立したナノレベル観察法を用いて、骨芽細胞の分化過程の経時的な観察を行うことで、基質小胞の形成分泌機構を明らかとすることを目指す。
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