| 研究課題/領域番号 |
17K19920
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| 研究機関 | 首都大学東京 |
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研究代表者 |
眞鍋 康子 首都大学東京, 人間健康科学研究科, 准教授 (60467412)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | マイオカイン / 骨格筋 |
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| 研究実績の概要 |
運動がもたらす多様な健康効果は、骨格筋から分泌されるマイオカインによってもたらされるという研究が進展している。しかし、これまでにマイオカインと報告されているものは、実際には「新規」ではない。それらは過去に骨格筋以外の臓器で分泌タンパク質として知られていたものが、骨格筋でも分泌されることが明らかになったものである。本研究では、次世代シーケンス法によるトランスクリプトーム解析から発見された新規マイオカイン（仮称#30020）が、骨格筋でペプチド・タンパク質に翻訳され、分泌され、生理的な役割を生じさせるかどうかを明らかにすることを目的としている。
H29年度はヒト骨格筋から#30020のクローニングを行った。次世代シークエンス解析から得られた#30020の遺伝子配列を元にクローニングを実施し、予想通り5.7ｋの遺伝子がクローニングできた。これを今後の実験ツールとして使うため、タグが付加されていない発現ベクター、または、N末、C末にHA-tagを付加した発現ベクターを作製した。HA-tagを付加した発現ベクターをマウスの下肢にエレクトロポレーション法により一過性に発現させ、タンパク質として発現しているかをHA抗体をもちいて検証したところ、＃30020はタンパク質として発現することが明らかとなった。今後は、＃30020そのものの抗体で発現を確かめる必要があるために、30020分子のペプチド断片（C末をターゲットとする）に対する抗体を作製してさらに検証をすすめる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H29年度はヒト骨格筋から#30020のクローニングを行った。次世代シークエンス解析から得られた#30020の遺伝子配列を元にクローニングを実施し、予想通り5.7ｋの遺伝子がクローニングできた。これを今後の実験ツールとして使うため、タグが付加されていないベクター、または、N末、C末にHA-tagを付加した発現ベクターを作製した。
マウス下肢の一方にTagつきのベクターを、もう片脚にはemptyベクターをエレクトポレーション法で導入し、強制発現させた。2週間後に骨格筋を摘出し、#30020がタンパク質として発現しているかを、HA抗体を用いて検証した。その結果、N末、C末のtagの位置に関わらず、タグ付き#30020を過剰発現させたマウスの骨格筋ではタンパク質として発現していることが明らかとなった。
以上の本年度の結果から、当初の予定通り目的遺伝子のクローニングを終えたことから、おおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
H29年度には#30020がタンパク質レベルで骨格筋に発現することをHA抗体をもちいて明らかにしたため、H30年度は＃30020抗体を用いて検証する。マウス下肢の1方に＃30020-HAtagベクターを、もう片脚にはemptyベクターを導入し、強制発現させる。それぞれの筋を回収し、作製した＃30020抗体と、HA抗体を用いて発現を検証する。
骨格筋での発現が検証できたら、骨格筋培養細胞に強制発現させる。過剰発現させた骨格筋細胞の培養上清を回収・濃縮して、ウェスタンブロッティングに供して、分泌されるか否かを検討する。もし何の刺激も与えないときに分泌が確認できなかった場合は、骨格筋細胞に電気的な刺激を与えて収縮させ、収縮させた培養上清を用いて検討する。また、#300020は切断サイトが予測されていることから、N末のシグナル配列が切断されるならば、1.2 kDaのC末側ペプチドが分泌型として検出される可能性もある。分泌型は分子量が小さく、ウェスタンブロッティングでの検証は難しいため、ELISA法または質量分析法により検証することも考慮する。
さらに、骨格筋での局在を明らかにするため、強制発現させた骨格筋から凍結横断切片を作製し、免疫染色法により#30020の細胞内での局在を明らかにする。
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