研究課題
運動がもたらす多様な健康効果は、骨格筋から分泌されるマイオカインによってもたらされるという研究が進展している。しかし、これまでにマイオカインと報告されているものは、実際には「新規」ではない。それらは過去に骨格筋以外の臓器で分泌タンパク質として知られていたものが、骨格筋でも分泌されることが明らかになったものである。本研究では、次世代シーケンス法によるトランスクリプトーム解析から発見された新規マイオカイン（仮称#30020）が、骨格筋でペプチド・タンパク質に翻訳され、分泌され、生理的な役割を生じさせるかどうかを明らかにすることを目的としている。これまでの結果、ヒト骨格筋における発現をPCRにより確認したところ、予測される位置にバンドが見られた。また、ヒト骨格筋から#30020の全長cDNA をクローニングして、HAのタグをつけ、今後のツールに使用するための発現ベクターを構築した。2018年度はHAタグ付きの発現ベクターをマウス骨格筋または骨格筋細胞に過剰発現させ、そのタンパク質として発現するかについてHA抗体と特異的抗体の作製により検証した。抗体の作製は、＃30020のC末側のペプチドをターゲットとした。その結果、HA抗体ではタンパク質の発現が確認できたが、＃30020の特異的抗体では明確な検出ができなかった。現在はさらに手法を変え、継続して研究を行っている。また、HAタグ付きの発現ベクターを過剰発現させたマウス骨格筋組織内での局在も同時並行で検証中である。＃30020の発現と分泌を証明したのちに、その生理的役割の解明につなげることで、＃30020のマイオカインとしての性質を明らかにしていく。
2: おおむね順調に進展している
昨年度までに#30020を骨格筋からクローニングし、実験ツールとして使うため、タグが付加されていないベクター、または、HA-tagを付加した発現ベクターを作製した。これらのベクターをin vivo エレクトロポレーション法にてマウス下肢に強制発現させ、HA抗体を用いたウェスタンブロッティングすることで#30020が骨格筋で発現すること確認している。H30年度は、骨格筋に#30020が内因性に発現していることを確かめるため、、＃30020分子のペプチド断片に対する抗体を作製して、ヒト骨格筋での発現を検証した。まず、作製した抗体が＃30020を認識できるかの検証を行った。マウス片脚に＃30020-HAtagベクターを、もう一方には空ベクターを強制発現させた骨格筋サンプルを用いて、作製した抗体と、HA抗体を用いて検証した。しかし作製した＃30020抗体ではHA抗体で確認される位置にバンドを確認することができなかった。HA抗体にくらべて作製した細胞の力価が低い可能性が考えられたので、より効率的に＃30020を発現させたサンプルを用いて再度検証することにした。そこで、これまでに作製していたベクターを細胞で薬剤選択が可能なベクターにサブクローニングし、C2C12細胞に強制発現させ薬剤選択し、発現した細胞のみを検証に用いることにした。しかし、C2C12への導入効率が悪く薬剤選択により死滅してしまい、検証に必要なサンプルを得ることができなかった。2019年度は、別の手法で引き続き検証予定である。これと並行して＃30020の骨格筋における発現様式を免疫染色法を用いて検証した。さらに、分泌タンパク質であるかを＃30020を強制発現させた細胞とヒト由来骨格筋細胞であるHu5KD3細胞を用いて行った。現在、明確なシグナルが得られておらず、引き続き検証していく予定である。
H30年度に作製した抗体が＃30020を検出できるかの検証を、サンプルを変えて検証する。HAタグ付きの＃30020を過剰発現させたサンプルをHA抗体により免疫沈降し、そのサンプルを用いて作製した抗体でウェスタンブロッティング法にて検出を試みる。これらの方法を用いても検証が不可能であった場合は、作製した抗体が目的のものを十分に認識できないと判断し、手法を質量分析法に変えて、再度確認する。＃30020を強制発現させたサンプルとヒト骨格筋サンプルを電気泳動により分離し、銀染色によりこれまでHA抗体で得られているバンドの位置にあるバンドを切り出して、質量分析法により＃30020の存在を明らかにする。さらに、＃30020の骨格筋での局在を明らかにするため、強制発現させた骨格筋から凍結横断切片を作製し、免疫染色法により#30020の細胞内での局在を明らかにする。＃30020の抗体で認識が不可能であった場合は、HA抗体で検証する。また、＃30020が分泌されるタンパク質であるか否かは、ヒト骨格筋細胞であるHu5KD3細胞を用いて、電気刺激による収縮の有無の状況下で培養上清を回収し、濃縮してウェスタンブロッティングにて分泌の検証を行う。もし、抗体が目的のものを認識できない抗体であった場合はHAタグ付きの＃30020を骨格筋細胞に強制発現させた細胞の培養上清を上記と同様の方法で回収・濃縮し、HA抗体でwesternブロッティング法により検証する。Hu5KD3細胞は株化された細胞であるため、上記方法で明確な結果が得られないときは、Lonzaからヒト初代培養細胞を購入して、検証を行う。
今年度購入予定のものが次年度になったため
すべて 2019 2018 その他
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件) 図書 (1件) 備考 (1件)
PLoS One.
巻: 13 ページ: e0206146
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206146
薬学雑誌
巻: 138 ページ: 1285-1290
https://doi.org/10.1248/yakushi.18-00091-5
日本内分泌学会雑誌
巻: 94 ページ: 292
FOOD Style21
巻: 22 ページ: 53-56
http://www.comp.tmu.ac.jp/muscle/index.html
