アマミノクロウサギの無限分裂細胞とゲノムの解明、生きる化石のゲノムの特徴は？

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K20055
• 研究機関: 岩手大学
• 研究代表者: 福田 智一 岩手大学, 理工学部, 教授 (40321640)
• 研究分担者: 村山 美穂 京都大学, 野生動物研究センター, 教授 (60293552)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2023-03-31
• キーワード: 絶滅危惧種 / 培養細胞 / ゲノム構造 / 無限分裂細胞

研究実績の概要

絶滅危惧種であるアマミノクロウサギの死亡個体の組織から合計6個体の初代培養細胞を得た。その初代培養細胞を元に以下の結果を得た。絶滅危惧種由来の培養細胞を取得し不幸な死亡事故による動物の死亡から貴重な学術資料を得た。
1) 遺伝子導入条件の最適化: EGFP(オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質)の発現ベクターを用いてレンチウィルスによって効率良く遺伝子導入できることを明らかにした。
2) 変異型CDK4、サイクリンD、TERT、EGFPの組み合わせで合計３種の細胞の作製に成功: 野生型(WT)、変異型CDK4とサイクリンDを発現する細胞(K4D)、変異型CDK4とサイクリンD、さらにTERTを発現する細胞(K4DT)、EGFPを発現する細胞を得た。こららの細胞由来のゲノムDNAを抽出しPCR法によって発現カセットの挿入を検出した。
3) 変異型CDK4、サイクリンD蛋白質を検出: ウェスタンブロットによって、導入した変異型CDK4、サイクリンDの発現を期待される分子量に特異的に検出した。蛋白質レベルで期待される組み合わせで遺伝子導入されていることを検出した。
4) HiseqXを用いたゲノム解析: アマミノクロウサギのゲノムDNAを材料にショートリードであるHiseqX次世代シークエンサーを用いて合計200Gbのゲノム配列を取得した。この情報量はおおよそ予想されるアマミノクロウサギのゲノムの80倍に相当する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の目標であった６個体からの初代培養細胞の作製を達成した。これらの初代培養細胞から変異型CDK4、サイクリンDおよびTERTを導入し組換え細胞の作製に成功した。また初代培養細胞から80倍に相当するゲノム配列を得た。これらの項目は研究計画立案時の目標である。以上のことからおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

・初代培養細胞の作成: ロードキルによって、年間10例以上アマミノクロウサギの死亡が生じている。あらかじめ初代培養用の培養液を送付しておき、不幸な事故によって生じた組織を培養液に浸漬、冷蔵宅急便にて岩手大学まで送付する。今まで４例のメス個体の初代培養に成功している。さらに4例の細胞保存を目指し初代培養を行う。

・初代培養細胞からの無限分裂細胞の作製: 研究代表者は変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)およびサイクリンDとテロメラーゼ酵素サブユニット(TERT)の発現によって元の細胞の性質を保持したまま、無限分裂を誘導できることを明らかにした。連続パッセージを行い、得られた組換え細胞が無限分裂に至っているか評価を行う。

・無限分裂細胞から得られたゲノムDNAの構造解析: 無限分裂化のための遺伝子はレンチウィルスによって導入する。レンチウィルスの遺伝子挿入は細胞によって場所がランダムであるので、細胞集団としてゲノム解析を行えば、特定のリードにおけるエラーとしてデータから排除することができる。PacBioを使用した別の次世代シークエンス実験を行う。PacBio法は、シークエンスのリード数はHiSeqと比較して少ないが、一回のリードの長さが10kb程度と長大であることに特徴がある。この一回の長いリードの特性を活かすことによって、島状になったゲノム配列のクラスターを連結する。

次年度使用額が生じた理由

PacBioシークエンサーによる予備的なシークエンス反応を外部業者に委託した。しかしPacBioシークエンサーのライブラリー作製に外部業者が失敗した。この失敗によってライブラリー作製費用は発生したが、シークエンス費用自体が発生しなかった。現在、国外の次世代シークエンスサービスを受注する会社へライブラリー作製から進行している。その反応におおよそ250万円の費用を使用する予定である。