| 研究課題/領域番号 |
17K20055
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
福田 智一 岩手大学, 理工学部, 教授 (40321640)
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| 研究分担者 |
村山 美穂 京都大学, 野生動物研究センター, 教授 (60293552)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 絶滅危惧種 / アマミノクロウサギ / ゲノム / 無限分裂 / 細胞保存 |
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| 研究実績の概要 |
交通事故で死亡したアマミノクロウサギの12個体から初代培養細胞を得た。これらの細胞を10cmシャーレ２枚以上に増殖させ、安定的に液体窒素中にて保存を行った。無限分裂細胞を作成するために、レンチウィルスにて変異型CDK4、サイクリンD、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)を導入した。変異型CDK4、サイクリンD、TERTを導入した細胞を取得し、K4DT(CDK4, Cyclin D, TERTの終わりのアルファベットをとったもの)細胞と名付けた。また、変異型CDK4およびサイクリンD遺伝子のみを入れた細胞をK4D細胞と名付けた。一定細胞数を播種し、その後にコンフルエントになった際に剥離し、細胞数を計測、さらに累積分裂回数を計測した。その結果、野生型細胞では継代15回目周辺に細胞増殖が鈍化するのに対して、K4DおよびK4DT細胞ではそのような増殖速度の低下が認められなかった。また細胞増殖が低下した細胞はSA-betaガラクトシダーゼ染色に陽性を示し、細胞老化が亢進していると考えられた。このことから我々が作製したアマミノクロウサギ由来K4DおよびK4DT細胞は無限分裂に至っている可能性が高いと判断した。このような無限分裂細胞をアマミノクロウサギ３個体からの細胞を用いて再現性を検討した。その結果、全ての個体でK4DおよびK4DTの組み合わせで遺伝子導入した細胞は細胞増殖速度の加速を認めた。これらの結果をもとに得られた細胞群が無限分裂能力を有しているか明らかにする予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに３個体のアマミノクロウサギ由来の細胞に関して遺伝子導入を終了した。これらの細胞に関して特異的なプライマーを用いてPCR法によってレンチウィルスによって挿入された発現カセットの存在を検出した。結果、K4DおよびK4DT細胞は、変異型CDK4およびCyclin DもしくはTERT遺伝子が期待される組み合わせで導入されていることが明らかになった。今後も連続継代を行い、無限分裂に至っているか明らかにする予定である。加えて特異的抗体を用いてウェスタンブロットによって導入遺伝子の発現を検出した。その結果、K4DおよびK4DT細胞では変異型CDK4およびサイクリンDタンパク質が効率よく翻訳されていることが明らかになった。さらにTERTに関してテロメア延長能力をストレッチPCR法にて検出する予定である。また、次世代シークエンスを用いるための高純度のゲノムDNAを精製する条件に関して最適化を行った。具体的にはゲノムDNAを通常のエタノール沈殿で析出する方法、陰イオン性のカラムを使用して分離する方法、磁気ビーズに吸着させ精製する３つの方法である。コスト面では磁気ビーズが最も高いが、ゲノムDNAの純度および回収率は最も高かった。一方、DNAの回収率はエタノール沈殿が最も低かったが、最も高分子のゲノムDNAを得ることが可能であった。これらの結果から、コスト、純度、高分子の３つの角度から考え、今後の全ゲノム解析を行う上でエタノール沈殿による精製法が最も適していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、得られた無限分裂細胞および初代培養細胞から、アマミノクロウサギの全ゲノム解析を実施する予定である。現在、イルミナ社のHiseq次世代シークエンサーでは得られるリード（一度に得られる断片の長さ）が100-150bpと比較的短い。このことは大量のリードが得られた場合でも、最終的なゲノム配列を得るために膨大な計算量が必要なことを示す。また、哺乳類の場合は反復配列が多いためにアセンブルにおいてどの断片か同定できない大量のリードが発生する原因になる。全ゲノム解析を実施しても、その配列がゲノムのどこに該当するか同定できなければ、今後の解析に利用することはできず、無意味な配列となる。これらの問題を解決するために、近年、一分子シークエンサーであるSequelと呼ばれる機器が開発された。本研究においてもロングシークエンサーであるSequelを使用しアマミノクロウサギのゲノム解析を実施する予定である。ロングリードシークエンサーの場合は一回のリードの長さがおおよそ10kbと長く、アセンブルする上で有利な点が多い。また一分子シークエンサーであるのでPCR反応で増幅を含まない。このことはGC含有率や立体構造をとりやすいゲノム部位においても解析が可能であることを示し、全ゲノム解析において理想的な次世代シークエンサーと考えられる。ただし、これらのシークエンサーは非常に高価であるために、岩手大学のような小規模地方大学では導入することはほぼ不可能に近い。この状況から現在、外部委託によってSequelシークエンサーによる解析を実施できるように準備を進めている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画通り2019年も引き続き、研究を遂行する。本研究においてロングシークエンサーであるSequelを使用しアマミノクロウサギのゲノム解析を実施する予定である。ロングリードシークエンサーの場合は一回のリードの長さがおおよそ10kbと長く、アセンブルする上で有利な点が多い。また一分子シークエンサーであるのでPCR反応で増幅を含まない。このことはGC含有率や立体構造をとりやすいゲノム部位においても解析が可能であることを示し、全ゲノム解析において理想的な次世代シークエンサーと考えられる。ただし、これらのシークエンサーは非常に高価であるために、岩手大学のような小規模地方大学では導入することはほぼ不可能に近い。この状況から現在、外部委託によってSequelシークエンサーによる解析を実施できるように準備を進めている。
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