| 研究課題/領域番号 |
17K20113
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| 研究機関 | 青山学院大学 |
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研究代表者 |
三井 敏之 青山学院大学, 理工学部, 教授 (40406814)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| キーワード | 心筋細胞 / 同期 / 刺激 |
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| 研究実績の概要 |
培養下にて、心筋＋繊維芽細胞の共培養へ、力学的刺激を与え、その影響を24h以上にわたり長期的に観測した。心筋細胞は、孵化前embryo より初代培養した、その集合体、心臓の組織片を使用した。画像処理による拍動間隔変化の解析の手始めとして、複数の組織片の同期化について、部位依存を調べた。部位による違いが現れたが、個体差をカバーするためには、100サンプルは必要で、現在、実験を継続して行いつつ、結果の統計をまとめている。また、ピエゾをもちいた刺激系を構築して、培養環境下にて、拍動周期と細胞の伸縮を模倣した周期的な刺激を、初代培養により自律拍動をする、あるいは、しない心筋細胞の集合体に与えて拍動の変化を長期的に観測した。刺激の周期(0.3 sec)は、自律の拍動間隔（0.5 sec）より短くした。典型的な自律拍動を行っている集合体の拍動は、その拍動間隔の分散が増加して、拍動間隔の平均時間も0.7sec程度に遅くなった。一方で、自律拍動の拍動間隔が平均より長い集合体（~1 sec）の場合、刺激の周期(0.5 sec)に近づいたが、拍動間隔に分散があり、同期については現在、解析中である。刺激の影響に関しては、抗体染色より、細胞数(心筋・繊維芽細胞)、gap junctionの密度変化も調べた。上記の結果をAPS March Meeting 2018. March 5-9, 2018. Los Angeles, CA.で報告して、また、鶏卵上での実験系を構築したサンフランシスコ大学のMikawaグループを訪問して、研究結果について議論した。画像処理のリアルタイムプロセッシングによる、刺激パラメータのフィードバック制御機構の構築は、インキュベータ内顕微鏡では、動画をＰＣに読み込ませる時点で、大きな時間のロスが発生したため、ＵＳＢ顕微鏡により、そのシステムの構築を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
画像処理のリアルタイムプロセッシングによる、刺激パラメータのフィードバック制御機構の構築は、ＵＳＢ顕微鏡により、そのシステムの構築を試みるとの変更をした関係で、遅れているが、一方で、刺激が拍動周期を遅くする現象は予測しておらず、刺激のパラメータを、どう変化させるかについて、今後の実験結果により、検討しなおす必要がある。しかし、拍動間隔が遅い集合体の拍動は、刺激なしでは変化しないが、刺激を与えると短くなる。これは新規的な発見を言えるので、今後は、自律拍動の拍動間隔が平均程度の集合体と、それより遅い集合体との異差を、生物学的（細胞密度、心筋・繊維芽比など）にも調べうる必要がある。鶏の細胞のgap junction密度と、その初代培養による変化については、過去に報告例がないため、刺激なしの場合についても、詳細を調べる必要がある。刺激の周期以外のパラメータについて、特に速さと振幅についても調べた。直感どおり、細胞にダメージを与えない程度において、最大の速さや振幅が大きな影響を与えた。今後は、拍動間隔以外の刺激パラメータを念頭に研究を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
画像処理のリアルタイムプロセッシングによる、刺激パラメータのフィードバック制御機構の構築については、1. USB顕微鏡からの動画による画像処理、2. 他のインキュベータ内顕微鏡の検討、3.labview推奨のカメラ使用による制御機構の構築、をパラレルに進める。1.はtime constant、2.はコストとカメラのspecification、 3. の場合、顕微鏡ステージ上に、ピエゾ制御による刺激針の内包したインキュベータの自作等の、課題を克服する必要があるが、リアルタイムフィードバック機構による生命の応答変化が、本研究の萌芽らしい新奇的課題である以上、完成させたい。一方で、長期的刺激による応答自体の結果は、すでに得られ、その解釈やシミュレーションや、更なる抗体染色により、具体的な生物としての応答（増殖、形態変化、gap junction密度などの細胞内変化）を調べる必要がある。また、複数の心臓の組織片の拍動同期化については、すでに50年前に行われた実験でもあるが、当時の実験系から比べて、画像取得や解像度の向上により、物理的な同期化のプロセスの詳細が調べられる。この実験系も今後も続け、抗体染色等も含めて、同期化するため心筋細胞の変化を見極める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、購入予定だった、インキュベータ内顕微鏡のJuLI FL NanoEnTek社では、画像取得から、直接データとして、ＰＣにlab viewなどのインターフェイスにより取り込むことができないため、他のカメラ・顕微鏡を検討。デモ機使用などの実施しつつ、機種選定を行い、適切なカメラを購入する。
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