研究課題
本研究では、英国公衆衛生局と共同でクリミア-コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)のナノポアシークエンサーMinIONによるウイルスゲノム配列決定法を開発した。今回、迅速かつ効率的にCCHFVゲノム配列を決定するため、RNA試料からMultiplex tiling PCRにてウイルス全長配列を増幅し、MinIONによるアンプリコンシークエンスを行う手法を採用した。昨年度、一部のゲノム領域で十分な深度が得られない現象がみられたが、tiling PCRの反応条件を改良することで、抽出RNAからウイルス全長配列をカバーする出力リードを得た。また、バイオインフォマティクス手法によりMinIONの出力リードからCCHFVのゲノム配列を決定するパイプラインを新たに構築した。異なるlineageに属する複数の配列既知のCCHFV株についてシークエンスを行い、GenBank上に登録される塩基配列と比較したところ、93-100%のシークエンス精度を得ることを確認した。タジキスタンにて採取されたCCHFV陽性マダニ試料について、本法にてウイルス全長配列(6株)を決定した。新たに決定した配列を用いて分子系統解析を行い、いずれの株も中東及び中国分離株が属するAsia-1 lineageに属することが分かった。また本研究では、ナノポアシークエンスによるメタゲノム解析を目的としたSISPA(Sequence-independent single primer amplification)法の最適化を行った。またsemi-nested RT-PCRによる網羅的ナイロウイルス検出法を新たに開発した。これらの手法はCCHFVに限らず、CCHFVが属するナイロウイルス、更にダニ媒介性ウイルスの分子疫学研究ツールとして有用であり、将来的なCCHFVを含むナイロウイルスの分子疫学研究への道筋をつけた。
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最新医学
巻: 74 ページ: 548-554
Journal of Virological Methods
巻: 269 ページ: 30-37
10.1016/j.jviromet.2019.04.010
