| 研究課題/領域番号 |
17KT0023
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
西田 宏記 大阪大学, 理学研究科, 教授 (60192689)
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| 研究分担者 |
小沼 健 大阪大学, 理学研究科, 助教 (30632103)
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| 研究期間 (年度) |
2017-07-18 – 2020-03-31
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| キーワード | 器官形成 / 消化管 / 形態形成 / 自己組織化 / オタマボヤ |
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| 研究実績の概要 |
体内には様々な器官が３次元に配置されている。また、それぞれの器官自体も3Dの構造を持っている。しかし、複雑な形態が個体差なく作られるしくみの理解は遅れている。3D形態ができあがっていくしくみの解明には、4D (3D+t)ライブイメージングが不可欠である。ライブイメージングには、サンプルが小さく全ての過程が急速に起こる系が適している。本研究では、オタマボヤ（Oikopleura dioica）をその系として、５時間の間に起こる消化管の形態形成とその構築原理を解明することを目的とする。この系は解析に値する充分な複雑さを持つが、他の動物の消化管形成に比してとても単純化された系である。全ての過程は５時間程度で完了する。内蔵の形態形成は自己組織化の例であり、オタマボヤでは62個の細胞の塊から口から、咽頭、胃、腸、肛門にかけて500個ほどの細胞でできている高度に組織化された内蔵ができあがる。消化管の形態を創成するしくみの素過程として、４つの現象に注目してそのしくみを探る。器官境界の形成、上皮極性の形成、管腔形成、管腔の体外への開口、である。全ての過程は５時間程度で完了するので、包括的な解析に最適な系である。この期間を通して精力的に4D（3D+t）ライブイメージングを行い、多面的かつ大量のデータの取得を行う。データの取得は、微分干渉顕微鏡、デコンボルーション顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行う。また、体幹部の形態形成過程において核(H2B-mCherry)・細胞膜（PH-YFP）を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影する。オタマボヤの幼生は幅が40 ミクロン程であり完全に透明なので、核を光らせZスタックを撮る場合、幼生の上焦点面から下焦点面までの像を得ることができる。現在、少なめのZスタックを含む蛍光タイムラプスビデオでは、５時間の全過程を一度に記録可能である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず、核と細胞膜染色により、成体の体幹部の3D構築を行った。これにより、消化管がどのような細胞構成になっているかを把握できた。次に、微分干渉顕微鏡を用い、4Dライブイメージングを行いかなりのデータ量を取得した。幼生を不動化するために、尾の切断とBrachyuryのノックダウンによる尾部脊索形成阻害の両方を行った。ただし、撮影中に、胚の体積が増加し、徐々に焦点面がずれるという問題が残された。また、核(H2B-mCherry)・細胞膜（PH-YFP）を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影も行っている。
器官境界の形成に関しては、異なるカドヘリンが器官原基特異的に発現し、器官境界での細胞接着性が弱まることによると考えている。日本産オタマボヤのゲノム配列は決定済みであり、アッセンブリーもほぼ完了した。そこで、ゲノム配列からカドヘリン遺伝子のリストアップを行った。オタマボヤには、カドヘリンの遺伝子は２６個存在することがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
蛍光タイムラプスビデオでの撮影をさらに続け、多くのデータ取得を目指す。既に孵化前の胚発生の細胞系譜には個体差がないことがわかっており、孵化後の細胞系譜にも個体差がない可能性がある（孵化後から形態形成完了まで、平均して３回しか細胞分裂は起こらない）。もしそうなら、それはこの系が持つもう一つの利点といえる。これにより、多個体のデータを統合し名前を付けた単一細胞解像度での細胞挙動を追跡できるようになるかもしれない。
器官境界の形成に関しては、カドヘリン遺伝子のリストアップを行ったので、次にstaged RNA-seq発現データベースのデータを参考にし、目的のステージで発現が認められるカドヘリンにターゲットを絞る。これらのカドヘリンの発現をin situ hybridizationで確認し期間原基特異的に発現を開始するカドヘリンを特定する。そしてその発現をノックダウンし、器官境界の形成におけるカドヘリンの機能を解析する。また同時に、管腔（口・肛門・鰓穴）の体外への開口過程にも注目し、カドヘリンの発現をモニターする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度は、顕微鏡イメージングを中心として研究を行ったが、分子生物学的実験はそれ程、進展させることができなかった。その理由は、日本産オタマボヤのゲノム配列のアッセンブリーが、共同研究先の遅れにより、完成に時間がかかり、本研究に使うべき候補遺伝子をオタマボヤのゲノムから選び出すのに時間がかかったからである。現在は、ゲノム配列から２６個のカドヘリンの遺伝子のリストアップを完了しており、これから、クローニングを行う。次年度は、精力的に分子生物学的実験を行うことにより、次年度使用額と翌年度分として請求した助成金を使用し、研究を進展させる予定である。
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